Медицина / 5. Педіатрія

д.мед.н., проф. Безруков Л.О., д.мед.н., проф. Колоскова О.К., к.мед.н., доц. Білоус Т.М., Григола О.Г.

Буковинський державний медичний університет, м. Чернівці, Україна

к.мед.н., доц. Бойчук Р.Р.

Чернівецький національний університет ім. Ю. Федьковича, Україна

ГЕНИ ГЛЮТАТІОН-S-ТРАНСФЕРАЗ ПРИ ЕОЗИНОФІЛЬНОМУ ТА ПАУЦИГРАНУЛОЦИТАРНОМУ ХАРАКТЕРІ ЗАПАЛЕННЯ БРОНХІВ У ХВОРИХ НА БРОНХІАЛЬНУ АСТМУ ДІТЕЙ

Вступ. Уявлення про гетерогенність характеру запалення бронхів при бронхіальній астмі (еозинофільний, нейтрофільний, пауцигранулоцитарний [1-3]) лежить в основі індивідуалізованого лікування даного захворювання [4]. Вважають, що неоднорідність запального процесу в даних хворих багато в чому визначається генетичною компонентою, зокрема, поліморфізмом генів суперсімейства глютатіон-S-трансфераз (GST). Виявлення генів „схильності” до розвитку різних запальних патернів бронхів має велике значення для формування адресного лікування бронхіальної астми, особливо у випадках, коли регламентована терапія виявляється недостатньо ефективною [5, 6]. Водночас роль делеційного поліморфізму генів GSTM1 та GSTT1, які мають суттєве значення в антиоксидантному захисті дихальних шляхів, у розвитку таких варіантів запалення бронхів як еозинофільний та пауцигранулоцитарний, залишаються вивченими недостатньо.

Мета роботи. Вивчити делеційний поліморфізм генів GSTM1 та GSTT1 у дітей, які хворіють на бронхіальну астму, що супроводжується ознаками еозинофільного або пауцигранулоцитарного запалення дихальних шляхів.

Матеріал і методи. Обстежено 69 дітей шкільного віку, які страждають на бронхіальну астму (БА). До складу І клінічної групи увійшли 46 хворих із ознаками еозинофільного характеру запалення бронхів, а ІІ групу сформували 23 пацієнта з пауцигранулоцитарним характером запалення дихальних шляхів. За основними клінічними характеристиками групи порівняння були зіставлювані. Так, серед хворих з еозинофільним фенотипом бронхіальної астми (ЕФБА) легка БА визначалася у 4 (8,7%), середньотяжка – у 15 дітей (32,6%), а тяжке персистування мало місце у 27 хворих (58,7%). У ІІ клінічній групі наведена вище тяжкість БА відповідно визначалася у 1 (4,3%) хворого, 10 (43,5%) дітей та 12 (52,2%) пацієнтів (P>0,05). У І клінічній групі БА до 3-річного віку визначалася у 47,8% випадків, а у ІІ – у 42,0% спостережень (P>0,05).

Усім дітям у позанападному періоді проведене комплексне обстеження, що, зокрема, передбачало визначення характеру запалення бронхів на підставі цитологічного аналізу індукованого мокротиння, одержаного шляхом інгаляції гіпертонічних (3%, 5%, 7%) розчинів натрію хлориду [7]. За наявності у мокротинні 3% та більше еозинофільних лейкоцитів верифікували еозинофільний характер запальних змін дихальних шляхів, а пауцигранулоцитарний варіант встановлювали за меншого вмісту даних гранулоцитів та кількості нейтрофільних лейкоцитів, яка не досягала 59,0% усіх клітин [1-3].

Виразність місцевого запального процесу бронхів оцінювали за вмістом метаболітів монооксиду нітрогену в конденсаті повітря, що видихається (КПВ), а неспецифічну реактивність бронхів - за індексом лабільності бронхів (ІЛБ) та її компонентами – індексом бронхоспазму (ІБС) у пробі з дозованим фізичним навантаженням (10-хвилинний біг) та індексом бронходиляції (ІБД) при вдихуванні сальбутамолу, а також чутливістю дихальних шляхів до гістаміну [8]. Усім дітям за допомогою прік-тестів визначали шкірну чутливість негайного типу до основних груп інгаляційних алергенів з використанням стандартних тестів виробництва ТОВ „Імунолог” (м.Вінниця, Україна).

Генетичні дослідження проводилися на кафедрі молекулярної генетики та біотехнології Чернівецького національного університету ім. Ю.Федьковича. Загальну геномну ДНК виділяли з периферійної крові, виявлення делецій у GSTM1, GSTT1 здійснювали методом мультиплексної ПЛР із використанням відповідних специфічних праймерів. Гомозиготні форми із делецією обох копій генів GSTM1 та GSTT1 позначали як M1del та Т1del. Відповідно наявність даних фрагментів на електрофореграмах свідчила про гомо- або гетерозиготність за нормальними копіями генів та позначалась як М1+ та Т1+.

Результати та їх обговорення. Беручи до уваги багатофакторний характер БА, в якому відіграють важливу роль спадкова схильність до атопії та патогенний вплив зовнішнього середовища, нами вивчені окремі показники даної взаємодії. Так, серед хворих І клінічної групи показник маси тіла при народженні більше 3400 г, що розглядається рядом авторів як ознака генетичної схильності до БА [9], мав місце у 71,0% випадків, а в групі порівняння – у 52,0% спостережень (P<0,05). На природному вигодовуванні у немовлячому періоді знаходилося 63,0% дітей із еозинофільним запаленням дихальних шляхів та 43,0% - із пауцигранулоцитарним варіантом (P>0,05). Попри те, що генеалогічний індекс за атопічними захворюваннями у представників ІІ клінічної групи був дещо вищим порівняно з хворими І групи (0,09 проти 0,06), успадкування БА частіше відзначалося у дітей із еозинофільним характером запалення дихальних шляхів (27,3% проти 17,4%). Слід також відмітити, що в оточенні дітей із пауцигранулоцитарним варіантом запалення бронхів виразнішим виявися пресинг несприятливих чинників оточуючого середовища. Так, у приміщенні, де мешкали ці діти, у 17,4% випадків знаходилися домашні тварини, а у 56,5% спостережень хворі виступали пасивними курцями. У І клінічній групі ці потенційно патогенні чинники визначалися відповідно у 6,0% та 17,4% випадків (P<0,01).

Відмічено, що делеції у структурі гену GSTT1 траплялися у дітей І клінічної групи у 21,7% випадків, а у ІІ групі – у 26,0% спостережень.

При генотипі GSTТ1del у дітей І клінічної групи виразнішою виявилася шкірна чутливість негайного типу до інгаляційних небактеріальних алергенів, ніж у дітей групи порівняння. Так, у середньому інтенсивність прік-тестів, виражена у „+”, у таких дітей становила 3,83±0,16 у.о., а в представників групи порівняння середня інтенсивність шкірних реакцій знаходилася на рівні 1,0±0,2 у.о. (P<0,05). Водночас, інші показники атопічної реактивності у дітей з еозинофільним характером запалення дихальних шляхів визначалися рідше, ніж у групі порівняння. Так, частота атопічного дерматиту у даних дітей мав місце у 30,0% випадків, а середній вміст загального IgE у сироватці крові становив 305,8 МО/мл. У дітей ІІ клінічної групи ці показники атопічної реактивності організму визначалися відповідно у 83,3% випадків та на рівні 669,3 МО/мл (P<0,05).

На противагу цьому, у дітей І клінічної групи визначалася виразніша неспецифічна реактивність бронхів до такого непрямого бронхопровокаційного стимулу як дозований біг. Так, бронхоспазм фізичного напруження у таких дітей у середньому становив 7,5%, а лабільність бронхів – 23,5±4,8%. У хворих із пауцигранулоцитарним характером запалення дихальних шляхів ці показники неспецифічної гіперреактивності бронхів відповідно становили 2,3% (Р=0,001) та 14,6±6,2% (Р=0,03).

Генотип M1del у хворих із еозинофільним характером запалення бронхів визначався у 32,6% випадків, а у групі порівняння – у 21,7% спостережень (P<0,05). За даного фенотипу у хворих І клінічної групи значно частіше визначалася тяжка БА (66,7% проти 3,0%, P<0,05), попри те, що такий показник запалення бронхів як вміст метаболітів монооксиду нітрогену у конденсаті повітря, що видихається (КПВ), у них виявився суттєво меншим (38,3 мкмоль/мл проти 55,6 мкмоль/мл, P<0,05), так само, як і чутливість бронхів до прямого бронхопровокаційного стимулу (гістаміну). Так, провокаційна концентрація гістаміну у представників І клінічної групи за наведеного вище генотипу становила у середньому 2,03 мг/мл, а у групі порівняння – 0,03 мг/мл (P<0,01).

Для оцінки впливу комбінацій виявленого делеційного поліморфізму генів на основні показники БА вивчена їх частота у групах порівняння (табл.)

Таблиця

Частота комбінацій поліморфізму генів GSTM1, GSTT1 у дітей груп порівняння

Клінічні групи	Кіль-кість хво-рих	Розподіл генотипів GSTM1, GSTT1
		Т1+М1+		Т1delM1+		T1+M1del		T1delM1del
		A	B	A	B	A	B	A	B
І група	46	23	50,0	8	17,4	13	28,3	2	4,3
ІІ група	23	14	60,9	4	17,4	3	13,0	2	8,7
Р		>0,05		>0,05		<0,05		>0,05

Примітка: А – абсолютна кількість; В – відносна кількість (%)

Варто відмітити, що представлена структура комбінацій поліморфізму генів GSTТ1 та GSTМ1 асоціювала з тяжкістю персистування захворювання, супутніми алергічними захворюваннями та підвищеною чутливістю до трофалергенів. Так, за наявності генотипу T1+M1del у хворих І клінічної групи у 15,4% випадків траплялися алергічний риніт та підвищена чутливість до харчових алергенів. Натомість, у дітей із пауцигранулоцитарним характером запалення бронхів за наявності вказаного вище генотипу алергічний риніт мав місце в усіх хворих, а гіперчутливість до трофалергенів не визначалася.

У хворих за генотипу Т1delM1+ тяжка БА при пауцигранулоцитарному характері запалення бронхів визначалася в усіх хворих, а при еозинофільному запальному варіанті – у 37,5% спостережень. Супутній алергічний риніт у представників І клінічної групи при вказаному генотипі мав місце у 12,5% випадків, атопічний дерматит – у 50,0% спостережень. У пацієнтів із пауцигранулоцитарним запальним фенотипом ознаки наведених захворювань не визначалися.

Водночас слід відзначити, що такі показники патологічного процесу при БА як вміст у крові загального IgE, метаболітів монооксиду нітрогену у КПВ та лабільність бронхів (ІЛБ) у дітей із еозинофільним характером запалення бронхів виявилися суттєво вищими, ніж у групі порівняння. Так, наведені маркери захворювання у представників І клінічної групи відповідно становили 905,8 МО/мл, 63,1 мкмоль/мл та 26,8%. У групі порівняння ці лабораторні та інструментальні показники відповідно становили 392,3 МО/мл, 45,8 мкмоль/мл та 13,6% (в усіх випадках P<0,05).

Таким чином, у хворих на БА дітей із ознаками еозинофільного і пауцигранулоцитарного запалення бронхів наявність делеційного поліморфізму генів GSTT1 та GSTM1 асоціює з тяжкістю захворювання, а також такими додатковими критеріями патологічного процесу як неспецифічна гіперреактивність бронхів та вміст монооксиду нітрогену у КВП в якості маркеру запалення дихальних шляхів, а також ознаками атопічної реактивності організму.

Висновки.

1. У хворих на бронхіальну астму з еозинофільним характером запалення бронхів по відношенню до пауцигранулоцитарного варіанту частіше має місце генотип GSTM1del (32,6% проти 21,7%, P<0,05) та несуттєво рідше – генотип GSTТ1del (21,7% проти 26,0%).

2. У дітей із еозинофільним запальним варіантом астми та генотипом GSTM1del частіше визначається тяжка бронхіальна астма (66,7% проти 3,0%), а також характерною є нижча бронхопровокаційна концентрація гістаміну (2,03 мг/мл проти 0,03 мг/мл).

3. При генотипі GSTТ1del у хворих із еозинофільним характером запалення дихальних шляхів відносно пауцигранулоцитарного варіанту виразнішою є шкірна чутливість до інгаляційних алергенів і лабільність бронхів у пробі з фізичним навантаженням та інгаляцією сальбутамолу (23,5% проти 14,6%, Р=0,03).

4. У дітей, хворих на бронхіальну астму, при комбінації генотипу Т1delM1+ із пауцигранулоцитарним характером запалення бронхів відносно еозинофільного варіанту частіше визначається тяжка форма захворювання (100% проти 37,5%) та супутній алергічний риніт (50,0% проти 12,0%).

Література:

1. Безруков Л.О. Порівняльний аналіз цитологічного складу мокротиння школярів, хворих на бронхіальну астму при еозинофільному та нейтрофільному характері запалення дихальних шляхів // Л.О. Безруков, О.К. Колоскова, Є.П. Ортеменка // Здоровье ребенка. – 2012. - №2 (37). - С. 28-30.

2. Sputum induction in children with difficult asthma: safety, feasibility and inflammatory cell patterns / C. Lex, D. N. Rayne, A. Zacharasiewich [et al.] // Pediatr. Pulmon. – 2005. – Vol. 39. – P. 318-324.

3. Induced sputum in asthma: from bench to bedside / P. Bakakos, F. Schleich, M. Alchanatis [et al.] // J. Curr. Med. Chem. – 2011. – Vol. 18 (10). – P. 1415-1422.

4. Glutathione transferases and development of new principles to overcome drug resistance // А. Sau, F. Pellizzari Tregno, F. Valentino [et al.] // Arch. Biochem. Biophys. – 2010. – Vol. 500. – P. 116-122.

5. Characterization of a human glutathione S-transferase mu cluster containing a duplicated GSTM1 gene that causes ultrarapid enzyme activity // R.A. McLellan, M. Oscarson, A.K. Alexandrie [et al.] // Mol. Pharmacol. – 1997. – Vol. 52. – P. 958-965.

6. Wu W. Role of GSTM1 in resistence to Lung Inflammation / W. Wu, D. Peden, D. Diaz-Sanchez // Free Radic. Med. - 2012. – Vol. 53, Is. 4. – Р. 721-729.

7. The use of induced sputum to investigate airway inflammation // I.D. Pavord, M.M. Pizzichini, E. Pizzichini [et al.] // Thorax. - 1997. - Vol. 52. - P. 498-501.

8. Histamine and metacholine inhalation tests / E.F. Juniper, D.W. Cockcroft, F.E. Hargreave. - Lund, Sweden, 1994. - 51 p.

9. Associations between postnatal weight gain, change in postnatal pulmonary function, formula feeding and early asthma / S. Turner, G. Zhang, S. Young [et al.] // Thorax. - 2008. - Vol. 63. - P. 234-239.