К

К.с.-х.н. Шарафова О.Ф., д.б.н. Поляков А.В., к.с.-х.н. Зонтикова С.А.

ГНУ ВНИИ овощеводства Россельхозакадемии, Россия

Технологические аспекты получения трансгенных растений капусты белокочанной, устойчивых к фитопатогенам

Капуста белокочанная (Brassica oleracea var. capitata L.) — одна из самых распространенных овощных культур во всем мире. В Российской Федерации капусту выращивают на площади 167,4 тыс. га, что занимает около 20% от площадей, занятых овощами. При потенциальной урожайности около 110 т/га, средняя урожайность по стране составляет 24,4 т/га [1].

Капуста является ценным пищевым и диетическим продуктом питания. Она обладает богатым химическим составом. В кочанах содержится в среднем 8,5% сухого вещества, в состав которого входят: углеводы (сахара) — в среднем 4,2%; азотистые вещества (в т.ч. аминокислоты); минеральные вещества, такие как соли кальция, магния, железа и др. В капусте содержатся практически все известные витамины. Она богата аскорбиновой кислотой, содержит фолевую кислоту - 0,9 — 1,9 мг/кг и фолиновую кислоту - 0,18 — 0,41 мг/кг, биотин (витамин Н) - 0,024 мг/ кг, токоферол (витамин Е) - 15 — 25 мг/кг, витамин Р - до 300 мг/кг. В кочанах капусты содержится в среднем 1,2 % «сырого» белка, из которого около 30% составляют свободные аминокислоты [2]. Не менее ценны и имеющиеся в капусте горчичные масла, нормализующие работу кишечника. Кроме того, белокочанная капуста широко признанна как ценный источник пищевых волокон. Клетчатка капусты способствует выведению из организма жироподобных веществ, и, в частности, холестерина [3]. Немаловажное значение капуста имеет и в качестве кормового растения. Поэтому, получение стабильного урожая капусты белокочанной является одной из важнейших задач селекции. Однако многочисленные заболевания, которым подвержена капуста, приводят к потерям значительной части урожая и сильно снижают качество продукции.

В связи с этим возникает необходимость получения устойчивых сортов и гибридов, что при использовании традиционных методов селекции является длительным и трудоёмким процессом. Однако решение этой задачи может быть ускорено с помощью методов генной инженерии, которая позволяет вводит в геном растений целевые гены и получать трансгенные растения с заданными признаками [4].

Попадьиным П.В. [5] была проведена успешная работа по трансформации капусты белокочанной с целью повышения её устойчивости к киле крестоцветных (возбудитель Plasmodiophora brassicae Wor.). В генотип инбредных родительских линий F₁ гибридов был введен ген редечного (Raphanus sativus) дефензина rs-ap, кодирующий короткие цистеинсодержащие пептиды широкого фунгицидного и бактерицидного действия.

Во ВНИИ фитопатологии из бактерии Pseudomonas fluorescens был выделен низкомолекулярный (16,9 кДа) термостабильный белок, названный микробным фактором 3 (MF3). Была обнаружена гомология между аминокислотной последовательностью MF3-белка и пептидил-пролил-цис/транс-изомеразами FKBP-типа (группа белков холодового шока). Показано, что белок, относящийся к этому семейству, способен индуцировать устойчивость растений к вирусным и грибным патогенам [6,7]. Была проведена работа по оценке эффективности применения гена mf3 для создания трансгенных растений цветной капусты и рапса. Результаты исследования семенного потомства этих трансгенных растений дают основание заключить, что экспрессия гена mf3 не оказывала негативного влияния на морфологию и развитие растений. Трансгенные растения рапса цветной капусты показали повышенный уровень устойчивости к грибному (Pl. brassicae Wor.) и вирусному (вирус мозаики турнепса) фитопатогенам [8].

Ген mf3 путем агробактериальной трансформации также был встроен в геном моркови (Daucus carota). Экспрессия трансгена придала растениям неспецифическую устойчивость к грибным патогенам: трансгенные растения моркови на 20-40% оказались более устойчивы к Alternaria dauci, A. radicina и Botrytis cinerea [9].

В своих исследованиях получение трансгенных растений капусты белокочанной проводили с помощью Agrobacterium tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN 19+13К, несущим целевой ген mf3, кодирующий MF3-белок (ppIase, выделенный из Pseudomonas fluorescens), придающий растениям неспецифическую устойчивость к грибной и вирусной инфекции [10]. Ген mf3 находится под контролем CaMV 35S промотора и терминатора экспрессии нопалинсинтазы. Плазмида содержит маркерный ген nptII, придающий растениям устойчивость к канамицину.

Технология получения трансгенных растений капусты белокочанной, устойчивых к киле и фузариозу включает 1) систему регенерации в условиях in vitro, 2) агробактериальную трансформацию и 3) оценку трансгенных растений.

Регенерационная система:

- в качестве эксплантов использовать семядоли и гипокотильные сегменты 7-суточных асептических проростков;

- для индукции морфогенеза экспланты культивировать на среде MS [11], содержащей 6 – бензиламинопурин (БАП) в концентрации 2,0 мг/л и а – нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0,1 мг/л;

- для размножения микропобегов использовать среду MS, содержащую БАП в концентрации 1,0 мг/л и НУК - 0,1 мг/л;

- укоренение микропобегов проводить на безгормональной среде MS.

Агробактериальная трансформация:

- трансформацию проводить Agrobacterium tumefaciens c конструкцией, несущей целевой ген mf3, придающий растениям неспецифическую устойчивость к грибным патогенам [10];

- семядоли и гипокотильные сегменты прекультивировать на питательной среде MS, содержащей 2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК в течение 7-9 суток;

- удалить около 50% эпидермиса (в виде тонких полос) у гипокотильных сегментов и делать свежий срез черешка семядоли;

- инокулировать экспланты в суточной суспензии агробактерий (концентрация 105 клеток/мл) в течение 30 минут; последующее сокультивирование проводить на агаризованной среде MS, содержащей 2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК в течение 2-3 суток;

- селекцию трансформантов проводить на среде MS, содержащей 2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК, 50 мг/л канамицина (Km) и 500 мг/л клафорана (Kl).

Оценка трансгенных растений:

- молекулярно-биологический анализ на наличие целевого (mf3) и маркерного (npt II ) генов;

- оценка на устойчивость к фитопатогенам при проращивании семян на селективном фоне (фузариевая кислота в концентрации 50 мг/л в течение 10-14 суток) и на инфекционном фоне (Pl. brassicae Wor.);

- изучение характера наследования трансгена в семенном потомстве Т₁ с помощью реципрокных скрещиваний;

- оценка по морфологическим признакам.

Уровень экспрессии трансгена зависит от многих факторов и в значительной мере от того, в какую область ядерного хроматина попал введенный ген. Экспрессия трансгена, как правило, высока при его попадании в область активного хроматина [12]. Наибольший эффект наблюдается при встраивании в ядерный геном трансформируемого организма лишь одной копии вводимого трансгена. При этом введенный ген наследуется в потомстве по законам Менделя и в результате в потомстве от самоопыления полученного трансгенного растения происходит расщепление на гетерозиготу (трансген / - ), доминантную (трансген / трансген) и рецессивную (- / - ) гомозиготы [13]. Однако существует целый ряд проблем, затрудняющих получение и использование трансгенных растений. Оказалось, что при встраивании в ядерный геном вводимая конструкция ДНК нередко претерпевает существенные изменения (перестройки, дупликации, инверсии и т.д.), что приводит к снижению экспрессии. Одной из причин является число идентичных копий гена, встроенных в геном: чем больше таких копий и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания генов. Таким образом, трансгенные культуры должны содержать: не более одного встроенного гена на гаплоидный геном; сигнальные части трансгена (промоторы, терминаторы и др.) не должны иметь длинных гомологий (более 100-300 п.о. ДНК) с участками хозяйского генома; фрагменты векторной плазмидной или вирусной ДНК должны быть по возможности полностью удалены из конструкции перед трансформацией [14].

Стабильно введенный ген должен передаваться потомству при семенном размножении, поэтому важно определить этот параметр на практике. Уровень транскрипции введенного гена оценивают обычно с помощью Northern-блотинга или количественных версий RT PCR. В ряде случаев экспрессию гена проще и надежнее контролировать по конечному белковому продукту или тому эффекту, который этот белок вызывает.

По литературным данным известно, что в зависимости от селекционного образца и штамма агробактерий эффективность трансформации капусты белокочанной проходит с частотой от 0,75% до 10,9% [5,13]. Предлагаемая технология позволяет получать трансгенные растения от различных сортов капусты белокочанной с частотой трансформации 4,3-5,6%, устойчивость которых к фузариозу на 9-23%, а к киле – 23-44% выше, чем у исходных образцов [15-17]. При этом трансгенные растения поколений Т₀-Т₁ по морфологическим признакам не отличаются от растений исходных (нетрансгенных) образцов.

Литература:

1. Литвинов С.С. Научные основы современного овощеводства. М., 2008, 746 с.

2. Бондарева Л.Л. Научное обоснование и разработка системы методов селекции и семеноводства капустных культур/ Автореферат дис….д.с.-х.н. — М., 2009. — 40 с.

3. Петрушко Ю.Н., Потемкина В.И., Федяй В.П. Белокочанная капуста. Современная ресурсосберегающая технология выращивания в условиях Приморского края. — Уссурийск, 2003. — 76 с.

4. Шевелуха В.С. Проблемы трансгенных технологий в XXI веке //III Московский Международный Конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Ч.1. — М., 2005. — с.206-207.

5. Попадьин П.В. Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням /Автореферат дис….к.б.н. — М., 2002. — 20 с.

6. Джавахия В.Г., Кромина К.Г. Белок холодового шока (БХШ), выделенный из Bacillus thuringiensis индуцирует устойчивость растений к вирусным, грибным и оомицетным патогенам, трансгенные растения табака, несущие ген CSPD более устойчивы к патогенам, чем соответствующие нетрансгенные растения //III Московский Международный Конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Ч.1. — М., 2005. — с.242.

7. Шумилина Д.В., Воинова Т.М., Джавахия В.Г. Микробный фактор3-база для создания новых биопестицидов //Защита и карантин растений- №10.- 2006 .- C. 20-21.

8. Шумилина Д.В. Изучение структуры и свойств пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы MF3, индуцирующей устойчивость растений к болезням /Автореферат дис….к.б.н. — М., 2007. — 26 с.

9. Baranski R., Klocke E., Nothnagel T. Enhancing resistance of transgenic carrot to fungal pathogens by the expression of Pseudomonas fluorescence microbial factor 3 (MF3) gene //Physiological and Molecular Plant Pathology. V.71 (2007), pp.88-95.

10. Dzhavakhia V. et al. “Proteins inducing multiple resistance of plants to phytopathogens and pests” WO2005061533 publication date 2005-07-07 to PCT International system to Finnish patent office

11. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassys with tobacco tissue cultures //Physiol. Plant., 1962. v.15. N.13. P. 473-497.

12. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с.

13. Грибова Т.Н. Создание трансгенных линий белокочанной капусты с новыми агротехническими свойствами /Автореферат дис….к.б.н. — М., 2006.—17 с.

14. Кочетов А.В. Проблемы трансгенеза. Феномен «замолкания» трансгенов и устойчивость растений к вирусным инфекциям // Вестник ЦС ВОГиС , — №5 — 1998.

15. Зонтикова С.А. Генетическая трансформация капусты белокочанной (Brassica oleracea var. capitata L.) на устойчивость к фитопатогенам (Plasmodiophora brassicae Wor. И Fusarium ssp.) / Автореферат дисс. к.с.-х.н.-М., 2009- 26 с.

16. Зонтикова С.А.. Шарафова О.Ф., Поляков А.В. Генетическая трансформация капусты для повышения устойчивости к фитопатогенам // Картофель и овощи.-2009.-№7.-С.24-25.

17. Шарафова О.Ф., Поляков А.В., Джавахия В.Г. Технология получения трансгенных растений капусты белокочанной, устойчивых к киле (Plasmodiophora brassicae Wor.) и фузариозу (Fusarium ssp.) // Материалы III Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 18-21 октября 2010 г.).-М.: ИФР.-С.86.