Экология/1. Состояние биосферы и его влияние на здоровье человека

Усенко О.В., к.б.н., доц.

Харківський національний автомобільно-дорожній університет

м. Харків, Україна

ВИКОРИСТАННЯ МУХ DROSOPHILA MELANOGASTER ДЛЯ

ОЦІНКИ ГЕНОТОКСИЧЕНОСТІ ОБ'ЄКТІВ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА

При рішенні проблеми збереження природної біологічної розмаїтості фауни і флори та охорони здоров’я людини необхідно одержання інформації про генетичну небезпеку забруднення об’єктів довкілля для попередження розвитку мутагенних процесів і спадкових захворювань.

Визначення генотоксичності об’єктів навколишнього природного середовища за допомогою методики біотестування на мухах Drosophila melanogaster має порівнянні з іншими тест-системами (бактерії, рослини, культура тканин та інші) ряд переваг, які обумовлені тим, що у дрозофіли можна виявити всі типи мутацій. Вона має мале число хромосом, короткий життєвий цикл, велику плідність; метаболічна активація речовин, які поступають до організму, така як у людини. Данні, які отримані за допомогою цієї тест-системи, можуть бути екстрапольовані на високоорганізованих тварин, що включають і ссавців, і використані як прогноз ризику забруднення середовища для здоров’я людини [1].

Об’єктами дослідження слугували лінії дикого типу Oregon-R і Canton-S.

При визначенні генотоксичності забруднень навколишнього природного середовища використовували метод обліку частоти домінантних летальних мутацій (ДЛМ), який дозволяє враховувати геномні, хромосомні та генні мутації; є відносно простим, тому що не потребує ліній тестерів, і рекомендується при перевірці мутагенних якостей лікарських препаратів [2].

Для використання метода ДЛМ при біотестування з метою визначення генотоксичності об’єктів довкілля необхідно вирішення наступних задач:

– установлення метрологічних характеристик методу і діапазону реагування на еталонну речовину,

– проведення апробації метода на природних, зворотних, питних водах, ґрунтах і донних відкладеннях.

Суть метода обліку частоти ДЛМ в наступному: імаго D. melanogaster (самців і самок окремо) обробляли природними, зворотними, питними водами, витяжками з ґрунтів і донних відкладень протягом 72 годин; потім самців і самок поміщали в окремі пробірки до схрещування в співвідношенні 1:1; через 24 години самок відсаджували на агарові пластинки, через 8 годин їх видаляли і підраховували загальну кількість відкладених яєць; через 48 годин розраховували % ДЛМ шляхом обліку трьох типів яєць: прозорих (незапліднених), матових (загибель до 9 годин ембріонального розвитку) і пофарбованих від жовтого до коричневого кольору (пізня ембріональна загибель після 9 годин розвитку); висновок про наявність або відсутність генотоксичності проби води (водної витяжки) робили на підставі встановлення перевищення частоти ДЛМ в досліді порівнянню з контролем; в якості генотоксичної речовини в експериментах використовували калій двохромовокислий, або біхромат калію (К₂Cr₂О₄); метрологічні характеристики встановлювали відповідно „керівному нормативному документу” (КНД 211.1.05) [3].

Визначення діапазону реагування тест-об’єкта на еталонну речовину і відтворюваності результатів біотестування на D. melanogaster.

З метою перевірки придатності тест-об’єкта для біотестування визначали діапазон реагування на еталонну речовину. Еталонною речовиною може буди яка-небудь речовина, якщо вона відповідає вимогам токсикологічних і фізико-хімічних характеристик (достатньо високий рівень токсичності, стабільність розчинів та інш.).

Для визначення діапазону реагування D. melanogaster було використано К₂Cr₂O₇. Ця речовина обрана еталонною тому, що вона не має в складі молекули води, і водні розчини її стабільні. Генотоксична активність виявлена в результаті досліджень як на мікроорганізмах, так і на ссавцях [4-8].

Вплив біхромату калія на частоту ДЛМ у D. Melanogaster досліджено у концентраціях від 0,1 до 15.0 мг/л. Результати показали, що частота ДЛМ у всіх випробуваних концентраціях К₂Cr₂O₇ статистично вірогідно перевищує контроль. При цьому перевищення % ДЛМ росте з збільшенням концентрації К₂Cr₂O₇ від 0,1 до 5 мг/л, збільшення порівнянні з контролем у 1,4-2,8 рази. При концентраціях 10.0 і 15.0 мг/л частота ДЛМ залишається на рівні концентрації К₂Cr₂O₇ 5 мг/л.

Таким чином, у результаті проведених досліджень були виявлені концентрації від 0,1 до 5 мг/л, що впливають на динаміку росту частоти ДЛМ. Для перевірки придатності тест-об’єкта до біотестування безпосередньо перед його проведенням або у процесі культивування лінії дрозофіли визначали ефективну концентрацію (ЕК) K₂Cr₂O₇, яка викликає вірогідне збільшення частоти ДЛМ. Якщо значення ЕК знаходяться у встановленому діапазоні реагування, тест-об’єкт можна використовувати для біотестування.

ЕК визначали в 16 незалежних експериментах. В результаті досліджень встановлено наступний діапазон реагування для D. melanogaster. 0,1 – 0,3 мг/л К₂Cr₂O₇.

Установка метрологічних характеристик необхідна для забезпечення єдиних визначень генотоксичності за даним методом. Головною метрологічною характеристикою методу біотестування є відтворюваність результатів. Відтворюваність результатів – характеристика якості біотестування, що відображає близькість результатів тестування, які отримані за єдиною методикою, на одній еталонній речовині, але в різних умовах (наприклад, у різний час).

В ходу статистичної обробки експериментальних даних поряд з другими показниками обчислювали дисперсію – величину, яка відображає ступень варіювання признаку, що уданому випадку і характеризує відтворюваність результатів визначень розчинів еталонної речовини (К₂Cr₂O₇) за досліджуваною ознакою (% ДЛМ). У наших дослідженнях дисперсія в середньому складала 32%, що відповідає концентрації К₂ Сr₂O₇ – 0,061 мг/л. Така низька величина концентрації біхромату калію, за якої ймовірно вірогідне перевищення контролю за % ДЛМ, свідчить про відтворюваність результатів визначень генотоксичності розчинів використаної еталонної речовини за досліджуваною ознакою.

Таким чином, у результаті проведених досліджень було встановлено відтворюваність методу, що забезпечує єдність визначень генотоксичності, та діапазон реагування тест-об’єкта на еталону речовину, використовується для перевірки придатності дрозофіли з метою біотестування і обумовлює вірогідність результатів.

З метою встановлення області використання метода біотестування на D. melanogaster для визначення генотоксичності об’єктів довкілля була проведена апробація на стічних, поверхневих і питних водах; витяжках з ґрунту і донних відкладів. В пробах води та витяжках визначали наявність чи відсутність генотоксичної дії на D. melanogaster за час біотестування. Результати апробації наведені у таблиці 1.

Таблиця 1 – Результати апробації методики біотестування на D. melanogaster

Об’єкти довкілля	Кількість проб		% генотоксичних проб
	Тестованих	Генотоксичних
Стічна вода	2	2	100
Поверхнева вода	5	5	100
Питна вода	120	68	56
Водні витяжки з ґрунту	102	38	38
Водні витяжки з донних відкладів	4	4	100

Наведені в таблиці 1 данні свідчать про переважному виявленні за допомогою апробованого методу генотоксичності проб стічної та поверхневої води, а також витяжки з донних відкладів, з яких усі випробувані виявили генотоксичність. Високий процент генотоксичної проб (68%) був виявлений при апробації на питних водах. При апробації на витяжках з ґрунту було виявлено 38 % генотоксичних проб.

Підсумки апробації свідчать про можливість використання метода біотестування на дрозофілах для генотоксичного аналізу вод з високим рівнем токсичності: стічних, поверхневих, забруднених питних вод; водних витяжок з донних відкладів і ґрунту.

Генотоксична оцінка водних джерел дозволяє враховувати ризик токсичного забруднення водного середовища для здоров'я людини. Щоб якомога раніше оцінити небезпека полютантів, що попадають у природні води, що використовуються населенням, рекомендується використовувати біотести, що дозволяють оперативно установити потенційну погрозу забруднення нормальному функціонуванню біоти і її здатність до самоочищення води і збереженню санітарного режиму на рівні встановлених нормативних вимог [9].

Оцінка генотоксичності об’єктів довкілля на підставі біотестування забезпечує ранню діагностику їх якості. Оперативно отримана інформація дозволяє провести наступну перевірку несприятливої ситуації прийнятими в медичній токсикології методами з використання теплокровних тварин і вчасно вжити заходів по усуненню назріваючої погрози здоров'ю населення і створення напруженої екологічної обстановки.

В результаті проведених досліджень виявлено залежність виникнення частоти ДЛМ у D. melanogaster від різних концентрацій К₂ Cr₂O₇ ; встановлені діапазон реагування тест- об’єкта на еталонну речовину та відтворюваність методу визначення генотоксичності за обліком % ДЛМ; проведена апробація методу на різних категоріях вод і водних витяжок з ґрунтів і донних відкладів з використанням D. melanogaster в якості тест-системи, на основі якої він рекомендується для експресного виявлення генотоксичності об’єктів навколишнього середовища.

Література:

1. Бочков Н.П. Наследственность человека и мутагены внешней среды / Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. - М.:Медицина, 1989. – Гл. 8. - С. 163-167

2. Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств новых лекарственных препаратов. - М.: Медицина, 1981. – 56 с.

3. Атестація методик біотестування: КНД 211.1.9.51-96: утв. Мінекобезпеки України 22.01.97. - Київ, 1997 – 33 с.

4. Bianchi V. Genetic effect of chromium compounds / Bianchi V., Cellotti L.. Lanfranchi G., Majona F., Marin G., Montaldi G. and others. // Mutat. Res., 1983. – Vol. 117. – P. 279-300

5. Deflora S. Study of 106 organic and in organs compounds in the Salmonella microsome test / Deflora S. // Carcinogenesis, 1981. – Vol. 2. – P. 283-298

6. Жуков В.С. Подходы к регламентации химических загрязнений окружающей среды, обладающих мутагенной активностью / Жуков В.С. // Медицинские проблемы окружающей среды. - Москва, 1981. – С. 88-95

7. Пашин Ю.В. Мутагенная активность соединений хрома / Пашин Ю.В., Козаченко В.Я. // Гигиена и санитария. 1981 - № 5. – С. 46-49

8. Imreh St. Cytogenetic effects of chromium in vivo and in vitro / Imreh St., Radulescu D. // Mutat. 1982. – Vol. 97. – P. 192-193

9. Красовский Г.Н. Система критериев комплексной оценки опасности химических веществ, загрязняющих окружающую среду / Красовский Г.Н., Авалиани С.Л., Жолдакова З.И., Косяков Г.Н. // Гигиена и санитария. – 1992, № 9-10. – С. 23-60.