Дунаев П

Дунаев П.Д., Иванкова А.В., Бойчук С.В., Мустафин И.Г.

Казанский государственный медицинский университет, Россия

Механизмы вирусной репликации и апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции in vitro

Актуальность.

Патогенез иммунологический нарушений, возникающих при ВИЧ-инфекции остается до конца не изученным и обуславливает проведение экспериментальных исследований. Показано, что в развития иммунодефицита при данном заболевании важное значение играют биологически активные вещества, вырабатывающиеся в ходе иммунного ответа – цитокины, в частности ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α [2; 4; 6]. В связи с этим, цель настоящего исследования – изучить роль ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α в регуляции процессов вирусной репликации и апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.

Материалы и методы исследования.

Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли центрифугированием на градиенте плотности раствора Фиколл-Пак. Клетки вносили в лунки плоскодонных планшетов и культивировали в течение 11 дней в среде RPMI 1640 с добавлением: L-глутамина, эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотиков. К культурам лимфоцитов (Лф) вносили цитокины ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α в физиологических концентрациях [1; 3; 5]. В отдельные плоскодонные планшеты помещали МНПК с целью моделирования ВИЧ-инфекции in vitro. Инфицирование клеточных культур производили сразу же в 1-й день, через 2 часа после добавления цитокинов. Для инфицирования использовался лабораторный штамм ВИЧ-1 NL4-3 (NIH Res&Reag. Prog., США). Количество инфицированных Лф (клеток с активной вирусной репликацией) определяли методом проточной цитометрии по внутриклеточному содержанию вирусного белка р24^gag. Репликацию ВИЧ-1 оценивали методом ИФА по уровню белка р24^gag в супернатантах клеточных культур. Апоптоз Лф оценивали методом проточной цитометрии по параметрам: 1) снижение величины трансмембранного митохондриального потенциала (ΔΨ_m) – флюорохром DiOC₆; 2) повышение экспрессии молекул фосфатидилсерина (ФС) – флюорохромы MC 540 и Ann V-FITC.

Результаты.

Внесение ВИЧ-1 в культуры Лф, инкубированные в отсутствии цитокинов не приводило к его репликации. После внесения ВИЧ-1 в культуры Лф, инкубированные с цитокинами, отмечалась вирусная репликация (р<0,001). Пик репликации ВИЧ-1 наблюдался на 6 день культивирования. Наиболее эффективными индукторами вирусной репликации являлись ИЛ-7 и ИЛ-2.

Цитокины в отсутствии инфицирования ВИЧ-1 поддерживали жизнеспособность Лф в культуре. Напротив, в инфицированных ВИЧ-1 культурах цитокины индуцировали гибель Лф: количество клеток стремительно уменьшалось в процессе культивирования (р<0,001). В данном случае гибель Лф происходила по механизму апоптоза. В присутствии цитокинов Лф с признаками апоптоза было достоверно больше в инфицированных культурах, чем в неинфицированных (р<0,001). Наиболее эффективным индуктором апоптоза Лф являлся ФНО-α (см. Рис. 1).

Рис. 1. Апоптоз лимфоцитов в неинфицированных и инфицированных ВИЧ-1 культурах, инкубированных в присутствии ФНО-α – 6 день культивирования. Лимфоциты с признаками апоптоза (в %) – в левом верхнем квадрате.

Проведенные исследования выявили, что в инфицированных культурах в присутствии цитокинов (ИЛ-2 и ИЛ-7) по механизму апоптоза погибали преимущественно неинфицированные Лф, в то время как Лф с активной репликацией вируса оставались жизнеспособными

Заключение.

Цитокины ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α in vitro индуцируют репликацию ВИЧ-1 в Лф, а также способствуют гибели неинфицированной популяции Лф по механизму апоптоза. При этом цитокины поддерживают жизнеспособность инфицированных Лф, тем самым способствуя репликации ВИЧ-1. Следовательно, цитокины ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α в норме являющиеся факторами, направленными на поддержание гомеостаза иммунной системы и формирование иммунного ответа, при ВИЧ-инфекции могут играть противоположную негативную роль, обуславливающую прогрессирование заболевания. Полученные результаты являются предпосылками для дальнейшего экспериментального изучения механизмов иммунологических нарушений, возникающих при ВИЧ-инфекции. В частности, актуальной задачей является изучение свойств белков ВИЧ-1. Показано, что белки вируса способны индуцировать гибель неинфицированных СD4⁺Т-Лф по механизму апоптоза. Вирусные белки запускают в неинфицированные СD4⁺Т-Лф программу апоптоза при контактном взаимодействии с ними. Механизмы действия данных белков весьма разнообразны. В частности, некоторые из них (вирусные белки Env, Nef, Tat) способны индуцировать активацию Лф и, следовательно, повышать чувствительность данных клеток к развитию активационного апоптоза [7, 8].

Литература:

1. Дунаев П.Д., Иванкова А.В., Бойчук С.В., Мустафин И.Г. Исследование роли цитокинов в патогенезе ВИЧ-инфекции // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. – 2010. – Т.2, №3. – С. 55-57.

2. Дунаев П.Д., Бойчук С.В., Мустафин И.Г. Свойства и роль фактора некроза опухолей альфа в патогенезе ВИЧ-инфекции // Казанский медицинский журнал. – 2012. – Т. 93, № 2. – С. 290-293.

3. Unutmaz D., KewalRamani V.N., Marmon S. et al. Cytokine signals are sufficient for HIV-1 infection of resting human T lymphocytes //J. Exp. Med. – 1999. – Vol. 189, № 11. – P. 1735- 1746.

4. Sirskij D., Theze J., Kumar A. et al. Disruption of the γ_ccytokine network in T cells during HIV infection // Cytokine. – 2008. – Vol. 43, № 8. – P. 1-14.

5. Chun T.W. , Engel D., Mizell S.B. et al. Induction of HIV-1 replication in latently infected CD4+T cells using a combination of cytokines // J. Exp. Med. – 1998. – Vol. 188, № 1. – P. 83-91.

6. Vandergeeten C., Fromentin R., Chomont. N. The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir // Cytokine & Growth Factor Reviews. – 2012. – Vol. 23, № 4-5. – P. 143-149.

7. James C.O., Huang M.B., Khan M. et al. Extracellular Nef protein targets CD4+T cells for apoptosis by interacting with CXCR4 surface receptors // J. Virol. – 2004. – Vol. 78, № 6. – P. 3099-3109.

8. Shedlock D.J., Hwang D., Choo A.Y. et al. HIV-1 viral genes and mitochondrial apoptosis // Apoptosis. – 2008. – Vol. 13, № 9. – P. 1088-1099.