Губаренко Ю. Ю., Більчук В. С., Вінниченко О. М.

Дніпропетровський національний університет ім. О. Гончара

Ізоферментні спектри пероксидази апікальних меристем кукурудзи різних генотипів за стресових умов

Велика група ферментів, які об’єднані загальною назвою пероксидази, приймає участь в процесах росту і диференціації рослинних клітин, трансдукції сигналів і реакції на вторгнення патогенів. Пероксидази являються чутливими індикаторами самих різних несприятливих дій зовнішнього середовища. Пероксидази вивчають за трьома важливими аспектами: біохімічна гетерогенність, генетичний поліморфізм та тимчасові і просторові особливості експресії генів пероксидази. Тільки дослідження, які ураховують всі три аспекти проблеми пероксидази, дозволяють правильно інтерпретувати зміни пероксидазної системи рослин в процесі розвитку і в відповіді на різні фактори середовища [1, 2]. Для виявлення функцій окремих пероксидаз в клітинах необхідно проведення ізоферментного аналізу, який дозволяє певно розрізнити генотипічну і фенотипічну мінливість пероксидази. Тому метою роботи було дослідження компонентного складу пероксидази апікальної меристеми коренів кукурудзи різних генотипів.

Об'єктом дослідження було коріння проростків кукурудзи гібриду Дніпровський, засухостійкі лінії КР 640/3, ДК 517 та незасухостійкі AS 3070, ДК 744, які вирощували на воді (контроль), розчинах нітрату кадмію (2,5*10^-4 моль/л) при температурі 27⁰С та 42⁰С. Електрофоретичний аналіз легрозчиних білків проводили в 7,5% ПАГе методом диск-електрофорезу з гістохімічним виявленням пероксидази сумішю бензидину з пероксидом водню [3]. Аналіз компонентного складу ферменту проводили за кількістю активних компонентів, їх вмістом та відносною електрофоретичною рухомістю (Rf).

Апікальні меристеми коренів контрольних зразків вивчаємих ліній кукурудзи містили від 5 до 9 ізоформ пероксидази. Найбільшу гетерогенність ферменту спостерігали в зразках лінії КР 640/3. Кількість компонентів ензиму в гібриді Дніпровський і лінії AS 3070 була однакова і складала 7 активних форм, але виявлена відмінність в їх Rf і кількісному вмісту активного білку. Компонентний склад пероксидази ліній ДК 517 і ДК 744 був менш гетерогенним в порівнянні з іншими лініями. Слід відмітити, що 4 компоненти з Rf 0,04, 0,34, 0,38 та 0,62 були присутні у складі зразків всіх досліджуємих ліній. В ізоферментному спектрі пероксидази гібриду Дніпровський 188 спостерігали додаткові компоненти з Rf 0,22, 0,55 та 0,70. В спектрі пероксидаз меристем ліній КР 640/3, Дк 517, AS 3070 виявлена загальна зона з невеликою пероксидазною активністю з Rf 0,69. Спектри пероксидаз більшості досліджуємих ліній були специфічні, що дозволяє ідентифікувати ці лінії за картиною пероксидазної активності. За звичай, високий поліморфізм рослинних пероксидаз дозволяє клітині використовувати альтернативні набори ізопероксидаз, які забезпечують нормальну життєздатність клітин.

За хронічної дії сполук кадмію на проростки в апікальних меристемах кукурудзи відбувались зміни в системі захисту клітин. Це підтверджують дослідження компонентного складу пероксидази. В спектрі ферменту незмінними залишаються тільки повільно рухомі компоненти з Rf 0,05, ізоензиму з Rf 0,36 і 0,38, та швидкорухомі форми з Rf 0,62. Аналіз гетерогенності складу пероксидази за дії кадмію показав, що в залежності від генотипу відбуваються два вида змін, а саме збільшення кількості компонентів та їх зменшення. Так ускладнення ізоферментного спектру пероксидази спостерігали для меристем гібриду Дніпровський 188, ліній ДК 517 та ДК 744 за дії сполук кадмію. У компонентному складі ензиму гібриду Дніпровський 188 з’являлись мінорні компоненти з Rf 0,17, 0,26, 0,56 та 0,60. В спектрі пероксидази лінії ДК 517 спостерігали нові компоненти з Rf 0,17, 0,35, 0,37, 0,56. Більш чутливою до дії кадмію була лінія ДК 744. В спектрі пероксидази апікальної меристеми коренів цієї лінії знайдено 4 нових компонента з Rf 0,35, 0,37, 0,55, 0,60. В спектрі ензиму меристем кукурудзи лінії КР 640/3 виявлено зникнення активного білку ферменту з Rf 0,12, 0,34, 0,52, 0,55, 0,69 та поява мінорних компонентів з Rf 0,16, 0,19. Компонентний склад пероксидази апікальних меристем кукурудзи лінії AS 3070 складався з 6 компонентів, при цьому не проявляв своєї активності ізофермент з Rf 0,34. Таким чином, в більшості варіантів за дії сполук кадмію в меристемі виявлено нові ізоферменти пероксидази з Rf 0,17, 0,35, 0,37, 0,56.

За дії гіпертермії пероксидаза в меристемах кукурудзи представлена 7 основними компонентами з Rf 0,05, 0,17, 0,35, 0,37, 0,55, 0,62 та 0,68. В складі ферменту в меристемах гібриду Дніпровський 188 на відміну від компонентного складу, характерного для ензиму досліджуємих ліній кукурудзи, зафіксовані активні форми з Rf 0,12, 0,22, 0,52.

Сумісна дія сполук кадмію та гіпертермії на проростки кукурудзи приводили до підвищення гетерогенності пероксидази в апікальних меристемах всіх вивчаємих ліній. Основними компонентами ензиму є активні форми з Rf 0,05, 0,17, 0,36, 0,38, 0,55, 0,69, які присутні за дії індивідуальних факторів, тобто сполук кадмію та гіпертермії. При комплексній дії стресорів в компонентному складі ензиму спостерігали появу двох додаткових активних компонентів з Rf 0,45 та 0,64, які були відсутні в попередніх варіантах. Тобто при сумісній дії сполук кадмію та гіпертермії на проростки кукурудзи ізоферментний склад пероксидази ускладнюється і з’являються її додаткові активні ізоформи, які були відсутні за дії індивідуальних компонентів стресу.

Таким чином за дії стресових факторів відбуваються перебудови компонентного складу пероксидази за рахунок зміни кількості ізоформ та вмісту активного білку в них. Показана роль окремих ізоформ в адаптації рослинного організму до стресових факторів.

Література:

1. Андреева В.А. Фермент пероксидаза.- М: Наука, 1998. -120с.

2. Колупаев Ю.Е. Активные формы кислорода в растениях при действии стрессоров: образование и возможные функции // Вісник харківського нац. агр. Унів.- 2007.- Вип. 3 (12).- С. 6-26

3. Сафронов В.И., Савфронова М.П. Иследование белков и ферментов растений методом электрофореза в ПАГе // Биохимические методы в физиологии растений.- М: Наука, 1971.-220 с.