Биологические науки/6. Микробиология

Линькова Ю.В., к.б.н., доцент Котова И.Б., д.б.н., профессор Нетрусов А.И.

Биологический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова, Россия, Москва

Особенности микробных сообществ, способных разрушать аминоароматические ксенобиотики в анаэробных условиях

В работе были изучены анаэробные микробные сообщества различного происхождения, использующих в своем метаболизме устойчивые и высокотоксичные азокрасители и ароматические амины. Такие соединения попадают в окружающую среду при производстве и использовании пестицидов, взрывчатых веществ, красителей, лекарственных препаратов, полимеров, пищевых добавок и товаров хозяйственного назначения. Широкое применение в промышленности и в быту аминозамещенных ароматических ксенобиотиков ведет к возрастанию их выброса в окружающую среду и принимает угрожающий характер из-за их быстрого распространения по трофическим цепям и токсического, мутагенного или канцерогенного влияния на живые организмы даже в малых дозах. Поскольку многие такие вещества в присутствии кислорода полимеризуются в трудноразлагаемые соединения, то их деградация зачастую более эффективна в анаэробных условиях.

В качестве субстратов в работе были использованы технические (Methyl Red) и пищевые (Tartrazine, Ponceau) азокрасители, а также некоторые продукты их анаэробного восстановления (сульфаниловая кислота, изомеры аминобензойных кислот (АБК), 5-аминосалициловая кислота (5-АСК)).

Концентрацию азотсодержащих ароматических субстратов и интермедиатов их распада определяли спектрофотометрическим методом в диапазоне длин волн 200-600 нм и с помощью ВЭЖХ. Для идентификации газообразных продуктов применяли газовую хроматографию.

Изменения микроскопической картины по ходу процесса регистрировали при помощи световой микроскопии фиксированных окрашенных препаратов, фазово-контрастной микроскопии живых препаратов и сканирующей электронной микроскопии. Особое внимание уделяли микробным сообществам, полностью минерализующим субстраты с образованием биогаза как альтернативного источника энергии.

Источниками биологического материала являлись анаэробные илы сооружений, очищающих бытовые и промышленные стоки, анаэробные донные отложения природных водоемов (содовых озер, горячих источников, рек, морей) и фекалии человека, для которых показана возможность осуществления метаногенного разложения органических веществ.

Анаэробные накопительные культуры получали путем длительной инкубации проб в жидкой анаэробной минеральной среде [1], содержащей основной ксенобиотик или каждый предполагаемый интермедиат процесса биодеструкции, в сосудах, герметично укупоренных резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками, в которых газовая фаза заменена на аргон или азот.

В работе были использованы различные сочетания температуры инкубации и кислотности среды (табл.1). Оптимальными для процесса биоконверсии оказались 30^оС и рН=6,5-7,5, причем даже при принудительном поддержании кислотности среды в щелочной области рН самопроизвольно устанавливался в этом диапазоне значений.

Таблица 1. Использованные значения параметров культивирования.

Варьируемые параметры культивирования	Значения параметра
Температура	20, 30 или 55^оС
рН	7,0, 8,0, 9,2 или 10,0, поддерживаемые принудительно в процессе инкубации или неподдерживаемые
Освещение	На свету или в темноте
Перемешивание	Без перемешивания или 220 об/мин

Большинство использованных азокрасителей подвергалось полному обесцвечиванию путем восстановления азосвязей в анаэробных условиях. Процесс деколоризации под действием микробных сообществ проходил, как правило, с высокой скоростью и без лаг-периода. Фекальные ассоциации не обесцвечивали азокраситель Methyl Red, а накопительные культуры из ила очистных сооружений пивоваренного завода и из донных отложений озера Цайдам не восстанавливали азосвязь в молекуле Tartrazine. Обесцвечивание в анаэробных условиях азокрасителей различной структуры микробными сообществами, отличающимися по свойствам, свидетельствует о неспецифичности реакции анаэробного восстановления азосвязи, а также о возможном участии в этом процессе факультативно анаэробных микроорганизмов. Внеклеточный разрыв азосвязи, по-видимому, происходит под действием восстановленных веществ-медиаторов (сульфида, НАДН и др.), генерируемых анаэробными микроорганизмами. Пополнение запаса восстановителей микробными клетками происходит за счет ферментативного восстановления их окисленной формы.

Продуктами восстановительного расщепления азокрасителей в анаэробных условиях являются различные ароматические амины. Полная минерализация азокрасителей в метаногенных условиях вызывает определенные трудности, поскольку образующиеся в качестве продуктов обесцвечивания ароматические амины различаются по биодеградабильности.

В стабильных накопительных культурах, разлагающих аминоароматические кислоты с образованием биогаза процессу деструкции предшествовал довольно длительный (7-300 сут) лаг-период, в течение которого происходила адаптация к субстрату и оптимизация численных соотношений микроорганизмов-партнеров. В активных накопительных культурах, отличающихся по источнику биологического материала, природа и последовательность появления промежуточных и конечных продуктов были сходны. Промежуточными продуктами всегда являлись СО₂, Н₂ и NH₄⁺, затем бензоат, ацетат. В качестве конечных продуктов процесса деструкции фиксировали СН₄ и СО₂.

Бензоил-КоА-путь можно считать наиболее вероятным биохимическим путем деструкции аминобензойных кислот данными микробными сообществами [2], исходя из анализа зарегистрированных интермедиатов. Выделенные нами активные накопительные культуры, изначально потреблявшие изомеры аминобензойных кислот, оказались также способны к деструкции с разной эффективностью ряда других ароматических соединений (бензоата, салицилата, бензилового и 2-гидроксибензилового спиртов, азокрасителя Acid Orange 6). Данные культуры не использовали в своём метаболизме флороглюцинол и резорцинол. Внесение в микробное сообщество доступного косубстрата (пирувата, глюкозы, этанола и др.) значительно увеличивало скорость деструкции субстратов.

Увеличение начальной концентрации как исходного субстрата (до 300 мг/л), так и инокулята в среде приводило к повышению активности биодеградации. Качественный состав промежуточных и конечных продуктов при этом от них не зависел. Было показано, что концентрация белка и степень разнообразия морфотипов микроорганизмов в исходном биологическом материале не влияет на активность биодеструкции.

В процессе потребления субстрата микробное сообщество демонстрировало возможность к самокоррекции структуры консорциума. Во всех микробных ассоциациях наблюдали значительное снижение биоразнообразия, смену доминирующих видов микроорганизмов, а также увеличение числа поврежденных клеток. Активные микробные сообщества состояли из отдельных крупных гранул, сплошных или с внутренней полостью, состоящих из мелких кокков и палочек. Различные стадии процесса биоконверсии аминоароматического ксенобиотика сопровождались изменениями микроскопической картины. Начало активного метаногенеза всегда совпадало с появлением в культуре тонких палочек разной длины, часто фрагментированных, собранных в очень длинные нити, иногда в чехлах.

Литература:

1. Kalyuzhnyi S.V., Sclyar V.I., Mosolova T.P., Kucherenko I.A., Russkova I.A., Degtyarova N.N. // Water Sci. Technol. 2000. V. 42. № 5-6. P. 363-370.

2. Heider J., Fuchs G. // Anaerobe.1997. V. 3. P. 1-22.