Шевкун Н.А., Сяткин С.П.

Российский Университет Дружбы Народов (РУДН), Москва.

Определение типа гибели раковых клеток при действии фотосенсибилизаторов бактериохлоринового ряда.

Фотосенсибилизаторы (ФС) – это органические молекулы, способные после светового воздействия продуцировать в биологических тканях образование активных форм кислорода и свободных радикалов, токсичных для клеток [1]. В Лаборатории молекулярной генетики внутриклеточного транспорта Института биологии гена РАН (заведующий проф. А.С.Соболев) был создан химерный полипептид - модульный рекомбинантный транспортер (МРТ) для направленного транспорта ФС в ядра раковых клеток. Каждое звено в структуре МРТ функционально обеспечивает прохождение молекулой определенного этапа транспорта от связывания с клеткой-мишенью до проникновения в ядро (Рис 1).

Рис. 1. Схема строения модульного полипептидного транспортера. Обозначения: Гис₆ - 6 остатков гистидина, ДТокс - транслокационный домен дифтерийного токсина, ГПБ - гемоглобиноподобный белок E.coli, СЯЛ – модифицированный сигнал ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40, Лиганд – эпидермальный фактор роста человека.

В качестве перспективного для медицины ФС использовали бактериохлорин р6 – восстановленный аналог порфирина. Специфичность накопления в раковых клетках конъюгата бактериохлорина р6 с модульным транспортером обеспечивается наличием эпидермального фактора роста человека, который связывается со сверхэкспрессированными рецепторами. Подобная система доставки призвана существенно усилить цитотоксический эффект фотодинамической терапии опухоли за счет повышения специфичности действия и снижения побочных эффектов [2].

Цель данной работы состояла в сравнении цитотоксических свойств и определении типов гибели клеток эпидермоидной карциномы человека при действии свободного бактериохлорина р6 и ФС в составе конъюгата с транспортером.

Материалы и методы. Процесс синтеза конъюгата состоит в активации карбоксильных групп бактериохлорина р6 с помощью 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида и N-гидроксицукцинимида, последующей 1 ч инкубации с полипептидом в присутствии 0,2% додецилсульфата натрия и многоступенчатого диализа.

Исследование фотоцитотоксического действия бактериохлорина р6 и его конъюгата с МРТ проводилось на культуре клеток эпидермоидной карциномы человека А-431. Для этого по 1 тыс. клеток рассевали в 96-луночные плашки, через 24 ч добавляли тестируемые препараты в концентрации 30 - 0.2 мкМ и инкубировали 22 ч. Облучали дозой белого света 270 кДж/м² с помощью графопроектора Пеленг-2400. Через 48 ч определяли количество выживших клеток по тесту с метиленовым синим.

Тип гибели клеток определяли визуально с помощью флуоресцентного микроскопа, после окрашивания клеток смесью Hoechst 33342 и йодида пропидия через 4 ч, после облучения. Интеркалирующий флуорофор Hoechst 33342 сильнее окрашивает ДНК делящихся, апоптотических и некротических клеток. У клеток в ходе некроза нарушается целостность плазматической мембраны, поэтому они окрашиваются также йодидом пропидия. Апоптозные клетки имеют характерные морфологические отличия (выпячивания (blebbing), конденсация и фрагментация ядер), хорошо заметные под микроскопом.

Результаты и выводы исследования. Продемонстрирована функциональность конъюгата ФС с МРТ, т.е. способность его в 100 раз усиливать фотоцитотоксичность бактериохлорина р6 in vitro (Рис 2). В широком диапазоне концентраций конъюгата ФС с МРТ преимущественным типом гибели клеток после облучения является апоптоз. Напротив, при фотоцитотоксическом действии свободного бактериохлорина р6 доля апоптических клеток невелика, и развивается некроз (Рис 3). Полученные результаты свидетельствуют, что при включении ФС в состав транспортера изменяется преимущественный механизм его действия, запускается процесс апоптоза.

Рис. 2. Выживаемость раковых клеток линии А-431 при действии свободного бактериохлорина р6 и конъюгата с модульным полипептидным транспортером Гис6‑ДТокс‑ГПБ‑(бактериохлорин р6)‑СЯЛ-ЭФР.

Рис. 3. Типы гибели клеток А-431 через 4 ч после облучения со свободным ФС и конъюгатом ФС с ЭФР-содержащим транспортером. EC50 – концентрация полумаксимального фотоцитотоксического эффекта.

Литература

1. Rosenkranz A. et al. Recombinant modular transporters for cell-specific nuclear delivery of locally acting drugs enhance photosensitizer activity // FASEB J. - 2003. – V. 17. – P. 1121-1123.

2. Tang MF et al. Recent progress in nanotechnology for cancer therapy // Chin J Cancer. Sep. - 2010. – V. 29, N9. – P. 775-80.