Євсютин А.М.⁽¹⁾, Мартинюк Н.Б.⁽²⁾, к.б.н. Дрегваль О.А. ⁽¹⁾, д.б.н. Вінніков А.І. ⁽¹⁾

Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара ⁽¹⁾

ДП «Ензим» ⁽²⁾

Вплив поверхнево-активних речовин на біоремедіацію

Забруднення довкілля нафтопродуктами є актуальною проблемою в усьому світі. Розливи сирої нафти зустрічаються повсюди як результат широкомасштабного добутку, переробки, транспортування та споживання. Процес природнього самовідновлення забрудненого довкілля дуже повільний. На ауторемедіацію забруднених нафтою ґрунтів при рівні забруднення 5 г/кг ґрунту знадобиться 30 років. Альтернативою природнього відновлення є біоремедіація – очищення довкілля за допомогою мікроорганізмів та рослин. Для забезпечення економічно вигідної, високо специфічної біоочистки від нафтопродуктів необхідно вивчати різноманітні мікроорганізми та її асоціації на предмет здатності її до деградації різних полютантів.

Важливим показником біологічної активності ґрунтів є ферментативна активність, що характеризує біохімічні процеси у ґрунті та потенційну здатність системи зберігати гомеостаз. Роль ферментів полягає також у здійсненні взаємодії між компонентами екосистеми [2]. Інтенсивність і характер біологічної деструкції забруднень визначається, у першу чергу, функціональною активністю мікроорганізмів, що засвоюють їх як джерело вуглецю та енергії [4]. У забрудненому ґрунті відновлювальні процеси відбуваються за участі ферментів різних класів. Дегідрогенази – це ферменти, що характеризують загальну метаболічну активність ґрунтової мікробіоти і беруть участь у розкладанні різноманітних забруднень [3], рівень їх активності у ґрунті відображає ефективність процесу біодеградації забруднень [1]. За активністю дегідрогенази можна оцінювати процеси біодеструкції забруднень у ґрунтах.

З метою дослідження нафтоокислюючих мікроорганізмів на придатність їх участі в процесах біоремедіації вивчали їх здатність до синтезу поверхнево-активних речовин (ПАР) та їх вплив на дегідрогеназну активність препарату ДНЗ (деструктору нафтових забруднювачів). Для досліджень використовували штами Pseudomonas stutzeri, Rhodococcus erytropolis, Rhodococcus maris із колекції мікроорганізмів ДП «Ензим».

Культивування мікроорганізмів здійснювали у колбах Ерлеймейєра на ротаційній качалці (220 об/хв.) за температури 28^оС на рідкому поживному середовищі Гудвіна, г/л: К₂НРО₄- 2,0; КН₂РО₄- 2,0; МgSO₄x7xH₂O -0,5; Na₃C₆H₅O₇x2H₂O – 1,0 ; дріжджовий екстракт -1,0 ; вода питна до 1 л.

В якості джерела вуглецю використовували глюкозу, сахарозу, , вазелінову олію, нафту, рідкі парафіни 20 г/л. В якості інокуляту використовували 48 годинну культуру , вирощену на рідких парафінах або сахарозі. Посівний матеріал вносили у кількості 10% від об’єму середовища.

Дегідрогеназну активність визначали колориметричним методом з використанням трифенілтетразолій хлориду. Поверхневий натяг заміряли на тензіометрі. Накопичення біомаси визначали за оптичною густиною на ФЕК КФК-2 при λ-540 нм. Кількість мікроорганізмів визначали чашковим методом Коха.

Біоремедіація – перспективний та екологічно прийнятий метод відновлення довкілля, однак вона часто буває малоефективною. Це пов’язано з низькою біодоступністю забруднень через їх сорбцію на ґрунті, гідрофобність та токсичність [1]. Відомо, що поверхнево-активні речовини є посередниками між мікробною клітиною і гідрофобним органічним забруднювачем, підвищують його біодоступність. Проведені дослідженн показали, що псевдомонади та родококи в присутності н-алканів здатні синтезувати активні сурфактантні комплекси, що знижують поверхневий натяг води (табл.1). Сурфактанти проявляють високу емульгуючи активність, утворюючи стабільні емульсії типу "'масло/вода" або "вода/масло". Біоемульгуючі комплекси родококів при додаванні до бурового шламу та нафтозабрудненого піску проявляли активні нафтовідмиваючі властивості, демонструючи через 48 годин 85-90% відшарування.

Таблиця 1

Здатність синтезувати активні сурфактантні комплекси псевдомонадами та родококами

Мікроорганізм	Титр колонiєутворюючих одиниць	Поверхневий натяг, 10^-3 Н/м
P. stutzeri	1,5х10^9	43,5
Rh. erytropolis	5,7х10^9	32,5
Rh. maris	4.5х10^8	54,8

Примітка: поверхневий натяг дистильованої води – 72,86 10^-3 Н/м.

При порівнянні впливу різних концентрацій ПАР (Твін-80 та біокомплексу, до складу якого входили досліджувані мікроорганізми) на дегідрогеназну активність препарату ДНЗ встановлено, що ПАРи збільшують активність дегідрогеназ на перші 2 доби культивування, причому біокомплекс за впливом не поступається Твіну-80 (табл.2).

Таблиця 2

Порівняння впливу різних концентрацій ПАР на дегідрогеназну активність препарату ДНЗ

ПАР	Дегідрогеназна активність (мкг Тфф/мл)
	1доба	2 доба	3 доба	4 доба	7 доба
Контроль	135	195	310	580	750
Твін-80 0,05 мг/мл	160	230	250	300	475
Біокомплекс 0,05 мг/мл	150	265	325	580	730

Найбільший ефект виявлено при використанні біокомплексу в концентрації 0,1 мг/мл (табл.3).

Таблиця 3

Порівняння впливу різних концентрацій ПАР на дегідрогеназну активність препарату ДНЗ

ПАР	Концентрація мг/мл	Дегідрогеназна активність (мкг Тфф/мл)
Біокомплекс	0,01	75
	0,02	87
	0,05	100
	0,1	162
	0,2	150
Твін-80	0,05	95
	0,1	175
	0,5	320
	1	420
Контроль	0	125

Одже, наявність ПАР в середовищі росту культур добре впливає на їх біосинтетичну активність, оскільки менше витрачається енергії на синтез особистих ПАР.

Таким чином, встановлено, що досліджувані культури P. stutzeri, Rh. erytropolis, Rh. maris в присутності н-алканів здатні синтезувати активні сурфактантні комплекси, що знижують поверхневий натяг води. Поверхнево-активні речовини є посередниками між мікробною клітиною і гідрофобним органічним забруднювачем, підвищують його біодоступність.

Література:

1. Сургучев М.Л., Горбунов А.Т., Забродин Д.П., Зискин Е.А., Малютина Г.С. Методы извлечения остаточной нефти. - М: Недра, 1991. - 347 с.

2. Коронелли Т.В. Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов. - Успехи микробиологии, 1980, Вьш.15,С.99-111.

3. Никовская Г.Н., Гордиенко А.С., Глоба Л.И. Гидрофильно-гидрофобные свойства микроорганизмов при различных условиях культивирования. - Микробиология, 1989, Т.58, №3, С.448-451.

4. Кучер Р.В., Лесик О.Ю., Єлісєєв С.А., Карпенко О.В., Туровський А.А., Вільданова-Марцишин Р.І., Полулях О.В. Емульгування вуглеводнів – нова властивість культури дріжджів Phaffm rhodozyma.- Доп.АН УРСР. Сер.Б. Геол., хім. та біол. науки, 1990, №8, С.49-53.