К.б.н. Колб А.В., д.м.н. Кухта В.К., к.м.н.
Бутвиловский В.Э.
Белорусский
государственный медицинский университет, Беларусь
Изменение аКТИВНОСТи КРЕАТИНКИНАЗЫ, АДЕНИЛАТКИНАЗЫ И ИХ
ИЗОФЕРМЕНТОВ В МИОКАРДЕ ПРи ТЕТРАДе ФАЛЛО
Тетрада Фалло
– один из наиболее часто встречающихся пороков сердца. Для этого порока характерны: сужение пути
оттока крови из правого желудочка; дефект межжелудочковой перегородки; смещение
аорты вправо; гипертрофия миокарда правого желудочка. Поэтому миокард больных с тетрадой Фалло со временем не только гипертрофируется (адаптация к постоянному
воздействию повышенной нагрузки), но и
испытывает хроническую гипоксию. Это приводит к изменению активности ферментов
и изоферментов в сердечной мышце. Сведения
об особенностях метаболизма в миокарде при врожденных пороках сердца крайне
малочисленны.
Целью
настоящей работы было изучение
ферментных и изоферментных изменений
в мышечных клетках миокарда больных с тетрадой Фалло [3]. Для исследования избраны креатинкиназа
(КК), ее изоферменты: MB- и митохондриальный (КК-MB и КК мит.
соответственно) и аденилаткиназа (АК) и ее митохондриальная форма
(АК мит.) [2].
Материалы и методы. Материалом для исследования послужила ткань гипертрофированного
миокарда правого желудочка, полученная во время операции по поводу радикальной
коррекции порока у 31-го больного с
тетрадой Фалло (средний возраст
больных – 11,5±1 год). Полученные образцы ткани содержались при температуре
0°C не более 30 мин,
а затем переносились в пластмассовые пробирки и хранились при температуре – 40°C от 1 до 15 дней.
В качестве контроля были использованы участки миокарда
правого желудочка 9-ти человек,
погибших в результате несчастного случая и имевших практически здоровое сердце
(средний возраст 25,5±2 года). Аутопсийные образцы получали через 3-8
часов после смерти, сразу же помещали
в жидкий азот и хранили в течение 3 месяцев.
Для проведения исследований брали кусочек миокарда
массой 50-100 мг,
измельчали ножницами и гомогенизировали в течение 2 мин
и 30 с в стеклянном гомогенизаторе с
тефлоновым пестиком при 800 об/мин
в среде выделения, содержащей фосфат натрия (0,1 моль/л,
рН 7,3) и тритон Х-100 (1 г/л). Гомогенат
центрифугировали при 10 000 g в течение 20 мин,
а супернатант отбирали и проводили в нем необходимые измерения.
Для разделения изоферментов КК использовали метод
ионообменной хроматографии, предложенный Mercer в
модификации А.Н. Козина [1]. Первая хроматографическая фракция содержала смесь
КК-ММ и КК мит., вторая – КК-МВ с незначительной (около 1 %) примесью КК-ВВ.
Для того чтобы судить об активности
КК мит., в первой хроматографической фракции ингибировали антисывороткой против
М субъединиц ММ-изофермент КК, а при определении активности КК- МВ не принимали
в расчет содержание КК-ВВ. Общую активность КК, активность КК-МВ и КК мит.
определяли методом Oliver-Rosalki в
модификации Szasz [1].
Изоферменты АК разделяли при помощи ионообменной
хроматографии по методу, предложенному Walker-Dow [4].
В первой хроматографической фракции содержался цитоплазматический изофермент АК, а во второй – АК
мит. Общую активность АК и активность АК мит. определяли по методу Oliver в модификации В.В. Куприянова [1]. Тестирование активностей ферментов и изоферментов осуществляли на анализаторе
скоростей реакций «LKB» при
температуре 37°C.
Результаты измерений выражали в международных единицах
активности ферментов (Е), соответствующих количеству энзима, катализирующего
превращение 1мкмоль субстрата в продукт за 1 мин
в стандартных условиях.
Концентрацию креатина определяли диацетильным методом.
Креатин был выбран в качестве критерия мышечной массы в связи с тем, что он
содержится только в мышечных клетках, а его концентрация в них линейно
коррелирует с содержанием мышечных белков. Полученные результаты обработаны
методами описательной статистики, достоверность различий определена по критерию
Стьюдента.
Полученные результаты. Результаты
исследований активностей ферментов и их изоэнзимов представлены в таблице.
|
Активность ферментов (Е) в расчете на
1 г массы сырой ткани и 1 мг
креатина, изоферментов (% от общей
активности ферментов) и содержание креатина (мг/г ткани) в контрольном миокарде и миокарде больных с
тетрадой Фалло (X ± Sx).
|
||||||||||||||||||||||||
|
Примечание: *— Р<0,05; **— Р<0,01;
***— Р<0,001. |
Из данных таблицы следует, что в миокарде больных с
тетрадой Фалло по сравнению с
контрольной группой при расчете на 1 г массы сырой ткани снижены
активности АК, КК и ее КК мит. и КК-МВ изоферментов,
а активность АК мит. и содержание креатина повышены. Общая активность АК у
больных с тетрадой Фалло в расчете на
1
г массы сырой ткани снижена достоверно, однако при перерасчете на
1
мг креатина это снижение еще более выражено (в 2,1 раза против 1,7). Снижение обшей активности
КК и ее митохондриального изофермента может быть объяснено замедлением
энергопродуцирующих процессов в
митохондриях, вызванным дефицитом кислорода. Повышение активности АК мит. можно объяснить тем, что АК
мит. располагается в межмембранном
пространстве митохондрий и ее функция тесно связана с функцией ацил-КоА-синтетазы – фермента, осуществляющего активацию жирных кислот,
при окислении которых обеспечивается 65-70
% потребности миокарда в энергии. Ацил-КоА-синтетаза требует для своей
деятельности АТФ и высвобождает АМФ, который ее ингибирует. В митохондриях при
достаточном количестве кислорода АК мит. предотвращает накопление избытка АМФ, но при дефиците кислорода АДФ
аккумулируется между мембранами митохондрий, что стимулирует АК мит. к
продукции в больших количествах АМФ, ингибируя таким образом окисление жирных
кислот, но зато сохраняя АТФ для нужд ишемизированного миокарда [4]. Несмотря на повышение активности АК
мит., вследствие уменьшения активности всей креатинкиназной системы и КК мит.,
в частности, перенос энергии через креатинкиназную реакцию замедляется.
Таким образом, проведенные
исследования показали, что в миокарде больных с тетрадой Фалло по сравнению с контрольной группой
активность аденилаткиназы, креатинкиназы и МВ-изофермента креатинкиназы
достоверно снижена, а активность митохондриального изофермента аденилаткиназы и
содержание креатина – повышены.
Литература
1.
Камышников
В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике:
В 2 т. Т.2. – Мн.: Беларусь, 2000. – 463 с.: ил.
2.
Липская Т.Ю. Физиологическая роль
креатинкиназной системы: эволюция представлений. Биохимия, 2001, том 66, в 2, с. 149-166
3.
Сапрыгин Д.Б. «Биомаркеры при сердечно-сосудистых заболеваниях: клиническая значимость в
диагностике и стратификации риска». Материалы
научно-практической конференции «Современная
лабораторная медицина: инновационные технологии лабораторного анализа и
диапазон клинического применения». Иркутск, 2011, с. 26-32
4.
Walker E.
J., Dow
J. W. Location and properties of two isoenzymes of cardiac
adenylate kinase.– Biochem. J., 1982, 203, 2, 361-369.