УДК: 577.1; 577.2; 577.15; 577.2.04

Кульбаева Г.А., Ригер Н.Г*., Ибрагимова С.А*., Карабалин А.Б*., Кастер*,

Сартаев А.С.

Биологические науки/9.Биохимия и биофизика

Магистрант Кульбаева Г.А.

Казахский Государственный Женский Педагогический Университет

*«Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина»,

Казахстан 050012 Досмухамедова 86. gulzat.kul@mail.ru

ФЕРМЕНТНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГЕНОТИПОВ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССОВЫМ

ФАКТОРАМ

Введение

Известно, что абиогенные и биогенные стрессовые факторы сильно уменьшают продуктивность злаковых культур. Поэтому одной из важных и актуальных задач, стоящих перед наукой, является изучение механизмов адаптации растений к стрессовым факторам. Эти исследования позволят успешно и быстро выводить устойчивые к различным стрессовым факторам новые сорта злаковых культур. Одним из наиболее сильных токсических агентов, возникающих при стрессе, является аммиак [1]. Аммиак оказывает повреждающее действие на биомембраны. Основная часть аммиака выделяется при действии глютаматдегидрогеназы на глютаминовую кислоту. В этом плане особое внимание следует обратить на растения, относящихся к семейству злаков. Важнейшей особенностью злаковых культур является то, что они имеют сильно выраженный обмен глютаминовой кислоты. Наличие большого количество глютамата в этих растениях при стрессе приводит к большому накоплению аммиака, что губительно действует на растения.

Таким образом, задача селекционеров состоит в том, чтобы вывести такие генотипы злаковых культур, которые бы меньше накапливали аммиак при стрессе. Ключом к созданию таких генотипов явилось следующее.

В лаборатории структуры и регуляции ферментов Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина был открыт новый путь расщепления глютамата без выделения токсического аммиака. Этот путь осуществляет ранее неизвестный ферментный комплекс (ФК), состоящий из малатдегидрогеназы (МДГ) и глютаматоксалоацетатаминотрансферазы (ГОАТ) [2]. В ходе реакции ферментного комплекса аминогруппа глютаминовой кислоты переходит в аминогруппу, синтезируемой при этом аспарагиновой кислоты. Таким образом, ферментный комплекс осуществляет расщепление глютамата без выделения свободного аммиака. Можно предположить, что генотипы с высоким уровнем активности ФК будут накапливать мало аммиака при действии стрессовых факторов, и тем самым они будут лучше адаптированы к действию стресса по сравнению с генотипами с низким уровнем активности ФК. То есть активность ФК может служить ферментным тестом устойчивости злаковых культур к стрессовым факторам. Наше предположение о связи активности ФК с устойчивостью злаковых культур экспериментально доказывается в этой статье.

Материалы и методы

Объектами нашего исследования явились семена следующих сортов яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.): «Attila», «Саратовская-29», «Дауыл», «Толкын», «Арай», «Казахстанская-10», а также следующих сортов ячменя (Hordeum vulgare): «Унумли-арпа», «Сауле», «Иран-4470», «Би-10», «Бота», «Арна». Были взяты сорта злаковых культур контрастные по устойчивости к засолению и к ржавчинным болезням.

Семена изучаемых растений были получены из коллекции «Казахского института земледелия и растениеводства» п. Алмалыбак, Карасайского района, Алматинской области, и из коллекции Института проблем биобезопасности пос. Гвардейский, Жамбылской области.

Реакционная смесь для определения ФК содержала 1,1 мМ NAD, 12 мМ малата и 87 мМ глютамата натрия, реакционная смесь доводилась до объема 2 мл 0,05 М трис-фосфатным буфером, рН 7,7 [3]. Активности ФК определяли при длине волны 340 нм на спектрофотометре типа Ultraspec-1100, фирма Bioscience (Великобритания). Концентрацию белка определяли на том же спектрофотометре по методу Брэдфорда [4]. Все опыты проводились в 6-7 кратной повторности, и в таблицах приводится данные наиболее типичного из опытов. Все результаты были подвергнуты стандартной статистической обработке.

Результаты и их обсуждение

Нами была изучена активность ФК как устойчивых, так и неустойчивых к стрессовым факторам сортов пшеницы и ячменя. Для изучения активности ФК были взяты семена пшеницы сортов, различающихся по устойчивости к засолению. Так, сорта пшеницы «Дауыл», «Толкын», «Арай» являются солеустойчивыми, а «Саратовская-29» и «Казахстанская-10» являются чувствительными к засолению. Для ячменя солеустойчивыми сортами являются сорта «Иран-4470» и «Би-10», в то время как чувствительными к засолению - сортами являются «Бота» и «Aрна». Для этого исследования семена изучаемых сортов замачивали в растворе 1,5 % NaCl. Семена проращивали в этом растворе в течение 3 суток. После чего проростки гомогенизировали 0,05 М трис - фосфатном буфере рН – 7,7. Затем гомогенат центрифугировали при 10000 х g в течение 10 мин. Полученный супернатант использовали для изучения активности ФК. Результаты этого исследования представлены в таблице 1. Таблица 1. Активность ФК МДГ-ГОАТ семян генотипов пшеницы и ячменя, различающихся по устойчивости к солевому стрессу.

№	Сорта		Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ NADH на 1 мг белка
			контроль	хлоридное засоление
1	Дауыл		428,23	631,55
2	Толкын		505,77	607,61
3	Арай		459,01	663,70
4	Саратовская-29		517,07	428,75
5	Казахстанская – 10		522,46	451,84
6		Иран-4470	255,85	376,68
7		Би-10	310,05	420,07
8		Бота	290,97	237,15
9		Арна	298,46	235,51

Как видно из таблицы, сорта пшеницы и ячменя с выраженной устойчивостью к засолению обладают свойством увеличивать активность ФК при действии засоления, тогда как неустойчивые сорта такой способностью не обладают. Они даже снижают активность ФК при засолении. Эти результаты говорят о важной роли ФК в процессах активной адаптации злаковых культур к солевому стрессу. Эти результаты однозначно говорят о том, что солеустойчивые сорта пшеницы и ячменя в отличие от неустойчивых сортов имеют механизм активной адаптации путем повышения активности ФК при действии засоления. Теперь необходимо было изучить активность ФК сортов пшеницы и ячменя, различающихся по устойчивости к другому виду стресса – ржавчинным болезням. Признанным стандартом устойчивости к ржавчине является сорт «Attila», а неустойчивым к ржавчине сортом является «Саратовская-29». У ячменя устойчивыми к ржавчине сортами является «Унумли-арпа» и «Сауле», а неустойчивыми сортами являются «Бота» и «Арна». Результаты изучения активности ФК семян сортов пшеницы и ячменя, контрастных по устойчивости к ржавчине, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Активность ФК семян сортов пшеницы и ячменя, контрастных по устойчивости к ржавчине

№ п/п	Сорта	Активность ФК мкМ NADH	% активность ФК
		на мл белка, 1мин
1	Attila	1007,07	170,52
2	Саратовская -29	453,13
3	Унумли-арпа	532,33	251,54
4	Сауле	201,02

Как видно из таблицы 2, устойчивый к ржавчине сорт пшеницы «Attila» имеет активность ФК, которая на 84 процента выше, чем неустойчивый к ржавчине сорт «Саратовская-29». Такая существенная разница в активностях ФК свидетельствует об очень важной роли ферментного комплекса в адаптации растения пшеницы к ржавчине. Эти результаты подтверждены при изучении активности ФК у контрастных сортов ячменя. Так, сорт «Унумли-арпа» имеет активность ФК более чем в два с половиной раза выше, чем неустойчивый к ржавчине сорт ячменя «Сауле». Такая громадная разница в активностях ФК говорит об очень важной роли ФК для устойчивости к ржавчине растений ячменя. Результаты опытов с сортами пшеницы и ячменя, различающихся по устойчивости к ржавчине полностью подтвердили нашу гипотезу о том, что устойчивые к ржавчине сорта имеют очень высокую активность ФК, тогда как неустойчивые сорта имеют низкую активность ФК. Таким образом, активность ФК может служить ферментным тестом для селекционной оценки устойчивости к ржавчине генотипов злаковых культур. Важная роль ФК для устойчивости к ржавчине объясняется тем, что ФК переводит аминогруппу глютамата на синтез аспартата - аминокислоты, в которой ржавчинные грибы не нуждаются. Это существенно ухудшает трофику грибка и приводит к его гибели [5,6].

В заключении можно с уверенностью сделать вывод о том, что активность ФК тесно связана с устойчивостью сортов злаковых культур к засолению и к ржавчинным болезням. Хотя механизмы устойчивости с участием ФК к засолению и ржавчине разные. Так, для устойчивости к ржавчине важным является высокий уровень активности ФК. Тогда как для устойчивости к засолению важным является механизм активной адаптации путем повышения активности ФК при действии соли. Таким образом, нами установлено, что ФК является одним из важнейших ферментов азотного обмена, играющего очень важную роль в обеспечении жизнеспособности растений и их адаптации к абиогенным и биогенным стрессовым факторам.

Литература

1. Регуляция метаболизма растений при засолении среды (Под ред. Л.К. Клышева.) Алма-Ата: Наука. - 1975. - С. 48-60.

2. M.K.Gilmanov, Zh.S. Kudiyarova, A.N.Sabitov, N. J.Omirbekova MDh- GOAT enzyme complex from wheat as new biosensor for glutamate determination// Biosensors and Bioelectronics, р.382, Shanhay, 2008

3. Колдасова А.С., Гильманов М.К., Шалахметова Г.А., Цветкова Б.М., Колдасова Ш.С. Методы изучения ферментного комплекса: малатдегидрогеназы-глютаматоксалоацетатаминотрансферазы, осуществляющего необратимое расщепление глютамата зерна пшеницы // Статьи методического сборника ИМБиБ "Методы молекулярной биологии, биохимии, иммунохимии и биотехнологии". – Алматы. - 1999. - С. 93

4. Bradford M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. – 1976. - Vol 72. – P. 248-254.

5. . Wagemaker MJ, Eastwood DC, van der Drift C, Jetten MS, Burton K, Van Griensven LJ, Op den Camp HJ. Argininosuccinate synthetase and argininosuccinate lyase: two ornithine cycle enzymes from Agaricus bisporus//Mycol Res. 2007 Apr;111(Pt 4):493-502. Epub 2007 Feb 8.

6. Wagemaker MJ, Welboren W, van der Drift C, Jetten MS, Van Griensven LJ, Op den Camp HJ. The ornithine cycle enzyme arginase from Agaricus bisporus and its role in urea accumulation in fruit bodies//Biochim Biophys Acta. 2005 Jan 11;1681(2-3):107-15. Epub 2004 Nov 24.

7. Панкова Е.И., Айдаров И.П., Ямнова И.А, Новикова А.Ф., Благоволин Н.С. Природное районирование засолённых почв бассейна Аральского моря география, генезис, эволюция. - М. -1996. – С.180