Сіренко О.В.

Кафедра клінічної лабораторної діагностики Харківської медичної академії післядипломної освіти   

Оцінка впливу субтоксичних доз багатокомпонентних органічних сумішей на фосфоліпідний склад клітинних мембран

У сучасних умовах безперервно зростаючого антропогенного навантаження, що призводить до розвитку екологічної патології, важливим заходом профілактичної медицини є донозологічна діагностика порушень гомеостазу та стану здоров’я населення [1]. Велика кількість авторів переконливо свідчить про неможливість формування вторинних маніфестних ознак екологічно обумовлених хвороб без порушення структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран, при чому негативний вплив ксенобіотиків здійснюється або внаслідок гострого ушкодження мембрани та загибелі клітини, або порушення функціонального стану ліпідного бішару мембран, що призводить до змін внутрішньоклітинного метаболізму [2]. Відомо, що інформативним методом оцінки характеру впливу ксенобіотиків на функціональний стан клітини є визначення щільності білково-ліпідного шару цитоплазматичної мембрани, основу якого складають ліпіди, вуглеводи, білки і вода [3].

     Принципово важливим моментом у процесі адаптації організму до впливу хімічних речовин є успішне збереження клітиною своїх функціональних властивостей і стабільності. Відомо, що одним з механізмів клітинної загибелі є підвищення проникливості мембрани при дії активних форм кисню для Са2+ та зниженні електричного потенціалу пробою, а ушкодження ліпідного бішару призводить до збільшення негативного заряду полярності, зниження мікров’язкості ліпідної фази, що свідчить про структурні ушкодження клітини та порушення її оптимальної фізіологічної функції [4]. В умовах хімічного стресу на клітину діє складний комплекс факторів, асоційований зі зміною фізико-хімічних параметрів середовища, що може індукувати у мембрані структурні перебудови, які прискорюють трансбіслойний перерозподіл ліпідів. У зв’язку з цим, роль асиметричного фосфоліпідного розподілення є дуже важливою, оскільки екстерналізація ФС може слугувати сигналом для макрофагів, які елімінують пошкоджені клітини з кров’яного русла [4]. Функціональна роль трансбіслойної асиметричної локалізації ФС, окрім розпізнавання у кров’яному руслі клітин з ознаками старіння або ушкодження, може заключатися у контролі механоеластичних властивостей мембрани, які відіграють важливу роль у стабілізації клітин до механічного або хімічного стресу.

         У цьому аспекті важливим питанням профілактичної медицини є своєчасне визначення впливу на організм вперше синтезованих хімічних речовин, до яких належать багатокомпонентні органічні суміші на основі гліколів (БКОС). Різні найменування даної групи хімічних речовин широко використовуються у народному господарстві та побуті, у той же час, їх дія на навколишнє середовище та здоров’я людини залишається недостатньо вивченою [5].

       Методи та матеріали. Эксперимент проведено на 90 щурах обох статей  популяції Вістар, масою 180±10г, яким протягом 45 діб щоденно внутрішньошлунково уводили 0,184 г/кг охолоджувальної рідини (ОР-40); 0,191 г/кг (ОР-65); 0,161 г/кг гальмівної рідини «Роса» (ГР); 0,117 г/кг маси тіла гідравлічної рідини для північного використання (ГдР), що дорівнює 1/100 LD50 даних органічних сумішей. Контрольну групу склали інтактні тварини, які отримували 2 мл води на добу. Кров для отримання еритроцитів та лейкоцитів брали з хвостової вени наприкінці експерименту. Дослідження виконані з урахуванням етичних вимог до експериментів з хребетними тваринами [6]. Фосфоліпіди мембран еритроцитів визначали, попередньо відмиваючи клітини розчином NaCL при 3-4-кратному центрифугуванні. По закінченні експерименту щурів декапитували під легким ефірним наркозом, виділяли та гомогенизували печінку, після чого проводили екстракцію [7]. Зразки фосфоліпідів аналізували із застосуванням методу двомірної хроматографії, за вмістом неорганічного фосфору. Реєстрували рівні фосфатидилхоліну (ФХ), сфингомиєліну (СМ), фосфатидилсеріну (ФС), лізофосфатидилхоліну (ЛФХ), фосфатидилетаноламіну (ФЕА) еритроцитів, а у печінці додатково визначали лізофосфатидилетаноламин (ЛФЕА), фосфатидилінозитол (ФІ), фосфатидну кислоту (ФК) і кардіоліпін (КЛ) з використанням стандартних розчинів фосфоліпідів по якісних показниках [8].

         Статистичну обробку отриманих даних проводили з використанням програми Statistica 4.5, результати визначали у виді середніх арифметичних та їх стандартних помилок, вірогідність різниці між величинами, що порівнювали, визначали за t-критерієм Стьюдента.

Результати та їх обговорення. Вплив складних органічних сумішей на ліпідну частину мембран еритроцитів, гепатоцитів і лейкоцитів визначали шляхом дослідження співвідношення мембранних фракцій фосфоліпідів цих клітин. Встановлено, що відсотковий вміст фракцій фосфоліпідів змінювався різноспрямовано під впливом субтоксичних доз БКОС (таблиця).

                                                                                                                     Таблиця

Співвідношення фракцій фосфоліпідів цитоплазматичних мембран клітин при дії 1/100 DL50 БКОС, (M ± m).

Фракції фосфоліпідів, (%)

Контроль

ГдР

ГР

ОР-40

ОР-65

еритроцити

 

ФЕА

22,5±1,5

19,4±1,4

23,3±1,5

25,0±1,6

21,0±1,5

ФХ

48,5±1,9

46,6±2,4

45,2±2,3

46,9±2,2

46,3±1,8

ЛФХ

3,8±0,9

6,9±0,6*

7,9±0,5*

6,8±1,2*

7,4±0,5*

СМ

12,8±0,9

12,5±1,4

16,9±0,9*

15,8±2,9*

16,2±1,4*

ФС

11,2±0,8

16,7±1,3*

7,3±0,4*

17,1±0,6*

8,6±0,4*

лейкоцити

ФЕА

24,5±1,8

16,3±0,7*

18,5±0,6*

20,8±0,5

19,4±0,7*

ФХ

44,7±1,2

48,7±1,5*

48,5±1,2*

52,5±0,9*

50,6±1,3*

ЛФХ

4,3±0,6

7,7±0,3*

6,9±0,7*

7,9±0,4*

5,2±1,2

СМ

14,5±0,8

17,8±0,07*

18,4±0,8

15,9±0,6*

19,3±0,5*

ФС

12,6±0,7

11,3±0,5

9,2±0,3*

8,5±0,7*

8,9±0,5*

гепатоцити

ФЕА

23,3±2,1

24,4±0,7

21,3±2,3

23,8±0,9

24,3±1,0

ФХ

39,3±3,1

41,9±1,5

40,5±3,1

38,9±1,5

42,5±2,7

СМ

16,0±0,9

12,4±2,2*

11,5±1,7*

11,9±0,8*

12,8±1,7*

ФС

9,0±1,2

8,5±1,3

9,8±0,6

10,3±1,1

9,3±0,7

ЛФЕА

1,3±0,6

4,9±0,7*

4,9±0,7*

6,7±0,8*

5,9±0,9*

ЛФХ

1,0±0,4

5,8±0,3*

6,5±0,5*

6,3±0,5*

4,9±0,7*

ФІ

7,7±0,9

4,4±0,6*

4,1±0,4*

3,9±0,4*

4,2±0,5*

КЛ

0,5±0,1

0,8±0,2

0,7±0,5

0,7±0,2

0,6±0,2

Примітка: * - розходження показників вірогідні, (р<0,05).

Органічні суміші не впливали на рівні ФЕА і ФХ в еритроцитах і гепатоцитах, у той же час, рівні лізоформ фосфоліпідів в усіх випадках вірогідно підвищувалися, що непрямо свідчило про стимуляцію вільнорадикальних процесів в організмі щурів при дії субтоксичних доз БКОС.  В мембранах еритроцитів визначали суттєве зростання фракцій СМ,  різноспрямовані зміни вмісту ФС, подібні тенденції реєстрували у мембранах лейкоцитів щурів, причому  рівні ФС переважно знижувалися. У той же час, відомо, що від кількості молекул ФС на зовнішній мембрані залежить швидкість елімінації ушкоджених клітин макрофагами [4]. Наслідком різноспрямованих змін відсотку ФС в мембранах еритроцитів і лейкоцитів може стати прискорена елімінація цих клітин з кров’яного русла експериментальних тварин. Субтоксичні дози БКОС не впливали на вміст ФС і КЛ у мембранах гепатоцитів щурів, а на тлі вірогідного зниження рівнів СМ і ФІ визначали зростання ЛФЕА та ЛФХ.  Перерозподіл фракцій фосфоліпідів, який визначався у збільшенні числа лізоформ, найбільш значним був у мембранах гепатоцитів, що може бути наслідком провідної ролі печінки у процесах детоксикації. Ряд авторів, які вивчали процеси ліпопероксидації в мікросомах, виділених з різних органів тварин, відзначають, що мікросоми печінки і головного мозку є найчутливішими до оксидативного стресу [4,5].

Здатність збільшувати число лізоформ фосфоліпідів мембран еритроцитів, лейкоцитів і гепатоцитів щурів визначено у всіх зразків БКОС. Отримані дані дозволяють припустити, що органічні суміші, синтезовані на основі гліколів, мають мембранотропні властивості за рахунок ініціації процесів перекисного окиснення ліпідів. Відомо, що активні форми кисню здатні стимулювати механізми клітинного апоптозу, а порушення співвідношення фракцій фосфоліпідів може бути пусковим моментом у розвитку фосфоліпідозу, патогенетичним для якого є накоплення комплексів фосфоліпід-ксенобіотик в лізосомах гепатоцитів, що призводить до змін метаболізму клітин печінки [9].  Підвищення окремих фракцій фосфоліпідів у мембранах еритроцитів змінює їх щільність, а великі концентрації поверхнево-активних фосфоліпідів  стимулюють гемоліз. Ліпіди представлені у мембрані у вигляді двох фосфоліпідних моношарів, де полярні головки молекул спрямовані у зовнішньо- та внутрішньоклітинне середовище. Між двома шарами мембрани ліпіди розташовані асиметрично – нейтральні ФХ і СМ переважно знаходяться у зовнішньому моношарі, а негативно заряджені молекули ФС, ФЕА і ФІ – у внутрішньому шарі [4]. Вплив хімічних речовин призводить до змін фізико-хімічних параметрів клітинного оточення, порушує механоеластичні властивості мембрани, може викликати перерозподіл мембранних ліпідів, що призводить до порушення асиметрії бішару.

Отримані дані щодо впливу субтоксичних доз БКОС на перерозподіл мембранних фосфоліпідних фракцій дозволяють визнати наявність у даної групи органічних сумішей мембранотропних властивостей, що при тривалому контакті може стати пусковим механізмом розвитку порушень внутрішньоклітинного метаболізму, зниження адаптивних функцій організму, виникнення преморбідних станів, а у подальшому – розвиток екологічної патології.

Література.

1.     Щербань М.Г. Методичні аспекти використання методології оцінки ризику здоров»ю населення при впливі факторів навколишнього середовища в Україні та Росії / М.Г.Щербань, В.В. М’ясоєдов, О.О.Шевченко, В.М.Савченко // Вісник ХНУ ім.. В.Н.Каразіна, 2010. - №898, Вип.19. – С. 97-104.

2.     Рахманин Ю. А. Научные основы диагностики донозологических нарушений гомеостаза при хронических химических нагрузках / Ю. А. Рахманин, Н. Н. Литвинов // Гигиена и санитария. – М. : Медицина. - №6. – 2004. – С. 48 – 50.

3.     Рахманин Ю. А. Методы донозологической диагностики экологически обусловленных заболеваний / Ю. А. Рахманин, Р. И. Михайлова, Н. В. Зайцева, Я. И. Вайсман // Гигиена и санитария. – М. : Медицина – 2001. - №5. – С. 58 - 59.

4.     Финдлей Дж. Биологические мембраны / Дж. Финдлей, С. Эванс - Пер. с англ. – М. : Медицина, 1991. – 371 с.

5.     Жуков В. И. Тормозные и гидравлические жидкости: гигиенические аспекты охраны окружающей и производственной среды / Жуков В.И., Резуненко Ю.К., Зайцева О.В. // Харьков, Принтал. – 1999. – 255 с.

6.     Руднева Е. Хельсинская декларация этических принципов: версия 2008 г. / Е. Руднева //Український медичний часопис. – 2009. - №1 (69) – І/ІІ. – С. 107 - 112.

7.     Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма : [методические рекомендации] / Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н. Н.; под ред. проф. Хавинсона В. Х. – СПб : ИПК «Фолиант», 2000. – 104 с.

8.     Брюзгина Т. С. Газохроматографическое определение жирных кислот фосфолипидов и свободного холестерина в одной пробе. / Т. С. Брюзгина, Э. Я. Кривченко, А. В. Дониш //Лабораторное дело. – 1991. - №18 – 19.

9.     Власенко М. А. Липидный спектр мембран эритроцитов у больных хроническим гломерулонефритом / М. А. Власенко, О. А. Чучелина // Проблеми сучасної медичної науки та освіти. – Х. : ”Фоліо”, 2004. - №2. – С. 13 – 15.