д.в.н. Гершун В.И.

к.в.н.  Туякова Р.К.

магистрант  Ермагамбетова А.Т.

 

Костанайский государственный университет имени А. Байтурсынова, Казахстан

 

Методы индикации листерий в кормах

 

 

В последние годы в мире наблюдается значительный рост числа заболевших листериозом, особенно лиц пожилого возраста. Большую опасность листерии представляют для беременных женщин и новорожденных.

       В настоящее время в России и Казахстане по данным официальной статистики заболеваемость животных листериозом продолжает расти из года в год. Не меньшую обеспокоенность вызывают участившиеся случаи заболевания листериозом людей.

            В Казахстане до последних лет заболеваемость практически не регистрировалась, что связано с многообразием клинических проявлений инфекции и с отсутствием подготовленной лабораторной базы.  По данным  Куттыкжановой Г.Г. и др. за последние 4 года по г. Алматы заболеваемость листериозом детей  увеличилась до 74,3%. Авторы отмечают, что полиморфизм клинических проявлений при листериозе затрудняет своевременную диагностику, поэтому более чем в 80% случаев больные поступали в стационар с ошибочным диагнозом [1].

На наш взгляд, основная проблема, которую придется решать микробиологическим лабораториям, занимающимся выделением листерий, будет связана с быстрой, эффективной и недорогой дифференциацией L.monocytogenes от непатогенных видов, часто выявляемых в кормах. Данные Гершуна В.И., Туяковой Р.К. (1999), Бакулова И.А.(1967) свидетельствуют о доминирующей роли алиментарного пути заражения животных листериозом.

Несмотря на то, что в настоящее время предложено значительное количество сред для индикации листерий из объектов внешней среды, выделить их из инфицированного материала не всегда удается, так как сопутствующая микрофлора заглушает медленный рост листерий. Сравнительно широкое применение для индикации листерий в различных странах получили среды, содержащие калий роданистый и налидиксовую кислоту, группу акридиновых соединений и, в частности, трипафлавин, в основе которых используют фосфатно-триптозный бульон (Дифко), среда Стюарта и её модификации. Многие исследователи отмечают высокую эффективность культивирования посевов при низкой температуре, так называемый «холодовой метод обогащения».

При индикации листерий из силоса В.И.Гершун использовал мясо-пептонный бульон с 10% хлористого натрия. Посев на этой среде культивировали в термостате при 370С в течение двух суток, при комнатной температуре в течение 5-6 суток и в холодильнике при 40С в течение 10-22 суток. Наибольшее количество положительных результатов было получено при культивировании посевов при комнатной температуре и в условиях холодильника [2].

       Сегодня все большее развитие получают современные молекулярно-биологические методы мониторинга листерий, такие, как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Herman et al. отмечает, что наибольшей чувствительности выявления L.monocytogenes (начиная с 0,1 КОЕ/г или мл) удалось достичь с использованием праймеров, фланкирующих фрагмент в гене hlyA кодирующем листериолизин О [3].  

        Алиева Е.В. установила, что применение магнитоуправляемых твердофазных аффинных сорбентов в тест-системе для иммуноферментного анализа, позволило повысить выявляемость возбудителя листериоза в объектах внешней среды на 9,4 – 11,8 %. Способность магноиммуносорбентов прочно (на уровне реакций антиген-антитело) фиксировать на своей поверхности искомый патоген дает возможность исследовать широкий диапазон проб, в том числе и сильно загрязненных, и осуществлять тщательную промывку проб от загрязнений, мешающих проведению индикационных реакций, тем самым,  повышая достоверность как положительных, так и отрицательных результатов      [4].

       Carles et al. предлагает для выявления листерий использовать хромогенные твердые питательные среды, позволяющие отличить колонии L.monocytogenes от колоний других видов листерий по цвету. В состав питательной среды введен субстрат для неспецифической фосфатидилинозитол-фосфолипазы С, который способны расщеплять L.monocytogenes и L.ivanovii. В среде имеется ксилоза и индикатор ее потребления, поэтому колонии или штрихи L.ivanovii, потребляющей ксилозу, будут иметь желтый ореол в отличие от колоний L.monocytogenes, которые окрашиваются в ярко-синий цвет [5].

         По данным Wiedmann, на основе моноклональных антител фирма bio Merieux (Франция) разработала метод твердофазной фермент – зависимой иммунофлюоресценции для выявления L.monocytogenes в автоматически работающем анализаторе VIDAS (Vitek Immuno Diagnostic Assay). Метод высоко- специфичен, позволяет в течение часа выявлять L.monocytogenes на фоне других видов листерий, не зависимо от физиологического состояния бактерий [6].

      Nannapaneni R. et al. при использовании моноклональных антител для выявления L.monocytogenes в пищевых продуктах отметил неабсолютную их специфичность: идентификация рода Listeria вполне успешна, а в пределах вида L.monocytogenes выявляются только наиболее вирулентные серотипы, часть серотипов не выявляется [7].

      Гершун В.И., Туякова Р.К. изучали следующие питательные среды для выделения листерий из молока – бульон Хоттингера с 3,75% роданистого калия с последующим пересевом на МПА с 0,004% налидиксовой кислоты; МППБ с 3,75% роданистого калия с последующим пересевом на МПА с теллуритом калия и теллурит – флоримицин – хлоридную среду; МПБ с 8,5% хлористого натрия с последующим пересевом на МПА с теллуритом калия и теллурит-флоримицин-хлоридную среду. Наиболее эффективными для выделения листерий авторы считают бульон Хоттингера с 3,75% роданистого калия с последующим пересевом на МПА с 0,004% налидиксовой кислоты, в результате чего листерии были выделены в 14 (93,3%) пробах [8].

        В настоящее время авторами для обнаружения листерий в комбинированном силосе, комбикорме (К-60-6), морковном соке, шроте, корне-, клубнеплодах и др., используется следующая схема исследования:

Проба корма 25г. (мл)

 

Питательный бульон с 1% глюкозой в соотношении 1: 9 (225 мл) –

при 370С на 24часа

 

Бульон Фрейзера (10,0 мл) при 370С на 24часа

 


Palcam-агар при 370С на 24-48часа

 


Отборные колонии пересевают на МПА с 1% глюкозой –

при 370С на 24часа

 

Микроскопия мазка

 

       Исследования проводились при следующих температурных режимах 40С, 180С и 370С. Концентрация листерий в условиях холодильника на 3-й сутки достигала 17,5 тыс. КОЕ/г, при комнатной температуре на 4-е сутки составила 92,0 тыс. КОЕ/г и в условиях термостата на 1-е сутки достигала 80 тыс. КОЕ/г.

    Таким образом, проблема индикации листерий представляет ещё определенные трудности и нуждается в дальнейшем изучении.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованных источников

1. Куттыкужанова Г.Г., Попова Н.В., Тажигалиева Н.Б. Листериоз у детей. //    

    г. Алматы. Материалы  diamed@kaznet.kz

2. Гершун В.И. Методика выделения листерий из силоса. // Ветеринария   

    1966. - №7.-с. 103-104.

3. Herman L. Detection of viable and dead Listeria monocytogenes by PCR // Food   

    Microbiol. 1997.V. 14. No 2. P. 103-110.

4. Алиева Е.В. Разработка лабораторных экспресс-методов  и технологии                                                          

    производства иммунодиагностических препаратов для выявления  

    возбудителей листериоза и кампилобактериоза. // Автореферат. М.-2008.

5. Carles B., Jacquet C., Duthoit M.L., Facon J.P. Evaluation of L.monocytogenes  

    in foodstuffs: RAPID’L.Mono // 5th Congress of the Societe Francaise de  

    Microbiologie. Lille, France, April 27-29, 1998.

6. Wiedmann M. Molecular subtyping methods for Listeria monocytogenes //

    J. AOAC Internet. 2002. V. 85. No 2. P. 350-354.

7. Nannapaneni R. et al. Unstable expression and thermal instability of a species-  

    specific cell surface epitope associated with a 66-kilodalton antigen recornized by  

    monoclonal antibody EM-7G1 within serotypes of Listeria monocytogenes grown  

    in nonselectiv and selectiv broths // App.Env.Microbiol. 1998. V. 64. No 8.

    P. 3070-3074.

8. Туякова Р.К. Пути инфицирования молока листериями. // Канд. дисс., 2001.    

    - с.19-20.