Лобищева Анна Володимирівна², Сирчін Сергій Олександрович¹, Омельчук Євген Олександрович²

¹Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, м. Київ, Україна

²Національний університет харчових технологій, м. Київ, Україна

ДОСЛІДЖЕННЯ СИНТЕЗУ ЦЕЛЮЛАЗ Corynascus sepedonium 1898 при твердофазному культивуванні при використанні різних целюлозовмісних середовищ

Було проведено дослідження здатності термофільного мікроміцета Corynascus sepedonium 1898, що здатен активно продукувати целюлолітичні ферменти, до росту на різних поживних середовищах при твердофазній ферментації.

Матеріали і методи. Об'єктом дослідження був термофільний мікроміцет C.sepedonium 1898, здатний до утворення позаклітинних ферментів целюлолітичного комплексу.

Культивування мікроміцета здійснювали поверхневим способом (твердофазне культивування) на таких середовищах:

1. Солома пшенична – 6,6 г/л, NaNO₃ – 2 г/л, KH₂PO₄ – 1 г/л, KCl – 0,5 г/л, MgSO₄ – 0,5 г/л, FeSO₄ – 0,01 г/л.

2. Солома пшенична – 5,3 г/л, листя кукурудзи – 1,3 г/л, NaNO₃ – 2 г/л, KH₂PO₄ – 1 г/л, KCl – 0,5 г/л, MgSO₄ – 0,5 г/л, FeSO₄ – 0,01 г/л.

3. Солома пшенична – 5,3 г/л, листя збірне – 1,3 г/л, NaNO₃ – 2 г/л, KH₂PO₄ – 1 г/л, KCl – 0,5 г/л, MgSO₄ – 0,5 г/л, FeSO₄ – 0,01 г/л.

4. Солома пшенична – 5,3 г/л, листя соняшника – 1,3 г/л, NaNO₃ – 2 г/л, KH₂PO₄ – 1 г/л, KCl – 0,5 г/л, MgSO₄ – 0,5 г/л, FeSO₄ – 0,01 г/л.

5. Солома пшенична – 5,3 г/л, буряковий жом – 1,3 г/л, NaNO₃ – 2 г/л, KH₂PO₄ – 1 г/л, KCl – 0,5 г/л, MgSO₄ – 0,5 г/л, FeSO₄ – 0,01 г/л.

6. Солома пшенична – 5,3 г/л, початки кукурудзяні – 1,3 г/л, NaNO₃ – 2 г/л, KH₂PO₄ – 1 г/л, KCl – 0,5 г/л, MgSO₄ – 0,5 г/л, FeSO₄ – 0,01 г/л.

Культивування здійснювалося при температурі 42 ˚С протягом 6 діб. Відбір культуральної рідини проводили на 6-й день культивування.

Ендоглюканазну активність визначали за методом, що базується на визначенні кількості цукрів (глюкози) при взаємодії ендоглюканази з натрієвою сіллю карбоксиметилцелюлози (0,5% розчину Na-КМЦ) при температурі 50 ˚С після 30 хв інкубування з 0,5 мл культуральної рідини. Активність обчислювали за методом [1;2].

Екзоглюканазну активність визначали за гідролізом фільтрувального паперу (FPU активність). Кількість редукуючи цукрі, за якими визначали екзоглюканазну активність, визначали методом з ДНС реактивом після інкубації 1 мл культуральної рідини і 1 мл 0,05М цитратного буфера (рН 4,5) з фільтрувальним папером (1х6 см) при температурі 50 ˚С протягом 1 год. [1;3].

Вміст білка в культуральній рідині визначали за методом Бредфорда.

Результати та обговорення. Було досліджено здатність штаму C.sepedonium 1898 до росту на поживних середовищах, що містять окрім пшеничної соломи інші джерела вуглецю, в умовах твердофазного культивування.

Найвищий рівень ендоглюканазної активності ми бачимо при рості мікроміцета на середовищі,що містить буряковий жом в якості додаткового джерела вуглецю (Рис.1).

Рис.1. Зміна ендоглюконазної активності при рості C.sepedonium 1898 на поживних середовищах з різним джерелом вуглецю.

Найвищий рівень екоглюканазної активності ми бачимо також при рості мікроміцета на середовищі,що містить буряковий жом в якості додаткового джерела вуглецю (Рис.2)

Слід звернути увагу на те, що за даними проведеного дослідження при додаванні певних додаткових джерел вуглецю активність целюлолітичних ферментів нижча, ніж без даних речовин.

Було встановлено, що листя соняшника містять речовини, що є інгібіторами утворення ендоглюканаз, кукурудзяні початки містять речовини, що є інгібіторами утворення ендоглюканаз. Також встановлено, що листя кукурудзи містить речовини, що призводять до інгібування синтезу целюлоз, а саме ендо- та екзоглюканаз.

Рис.2. Зміна екоглюконазної активності при рості C.sepedonium 1898 на поживних середовищах з різним джерелом вуглецю.

Список використаної літератури

1. Ghose T.K. Measurement of Cellulase Activities // Pure & Appl. Chem. – 1987. – 59, N 2. – P. 257 - 268.

2. Zhang Y.H.P., et al. Cellulase Assays // in: Mielenz (ed.), Biofuels: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 2009. – V. 581. – Р. 213–231.

3. Mehdi Dashtban, Miranda Maki. Cellulase activities in biomass conversion: measurement methods and comparison// Critical Reviews in Biotechnology – 2010. – N 8. –P. 3-10.