Биологические науки / 5
Молекулярная биология
Д.
б. н. Телесманич Н.Р.2, Чайка С.О.2, Микашинович З.И.2
, Гапон М.Н.1, Чайка И.А2.
1 Ростов-на-Дону, Россия, ФБУН Ростовский
НИИ микробиологии и паразитологии;
2 Ростов-на-Дону, Россия, ГБОУ ВПО
Ростовский Государственный Медицинский Университет Минздрава, кафедра общей и
клинической биохимии №1.
Метод линейной масс-спектрометрии для создания и
анализа протеомных паспортов энтеробактерий
В настоящее время развиваются новые
молекулярные подходы к изучению инфекционных и соматических болезней,
использующие современные достижения протеомного анализа. Метод MALDI-TOF
масс-спектрометрии основан на разделении белков в вакууме по их подвижности,
посредством сокристаллизации исследуемого вещества со специальным веществом
(матрицей) – α-4-гидроксикоричной кислотой, разбивкой с помощью лазерного
луча и разделением молекул в времяпролетном анализаторе Time of fly (TOF).
Аналит разбивается на отдельные молекулы, которые имеют разную массу. Легкие
ионы летят в условиях глубокого вакуума быстрее, тяжелые – медленнее, все они
ударяются о детектор в разное время, где их удары оцифровывается и им
присваивается с сответствующий масс - заряд, определяющий спектр молекулярных
масс аналита.
Метод MALDI-TOF
дает возможность получать уникальные для изучаемого объекта масс-спектры,
являющиеся его метаболическим "отпечатком пальцев", отражением
транскрипта клетки, его рибосомальных белков. Наблюдаемый в масс-спектрах
белковый профиль дает возможность прямого наблюдения транслированной
последовательности ДНК и сравним с методом мультилокусного секвенирования на
основе измерения спектра разных молекулярных масс объекта.
Использование масс-спектрометрии для создания
прогностических алгоритмов на основе биохимического протеомного анализа,
осуществляется с помощью прямого белкового профилирования исследуемого объекта.
Основным направлением здесь является создание авторских персональных баз данных
масс-спектрометрических профилей, например, клеток различных типов опухолей,
позволяющих осуществить достоверную идентификацию ткани в норме и патологии,
или баз данных виртуальных коллекций микроорганизмов, что позволяет провести
поиск биохимических маркеров инфекционной опасности.
Цель работы: Создание виртуальных коллекций
масс-спектров константных рибосомальных белков различных представителей
энтеробактерий для идентификации маркеров оценки тяжести кишечных заболеваний.
В этой связи нами созданы базы данных
масс-спектрометрических профилей холерных вибрионов и идентифицированы пять
основных пиков белков, отличающих возбудителей холеры от энтеропатогенных
вибрионов в виртуальном формате. Показано, что штаммы возбудителя холеры эльтор
имеют пять мажорных пиков масс-зарядов, соответствующих молекулярным массам
3200 Да, 4500 Да, 5100 да, 6500 Да. Штаммы энтеропатогенных вибрионов не О1/не
О139 серогрупп отличаются наличием только 1-2 мажорных пиков с масс – зарядом (m/z)
4000 – 4500 Да. Построение дендрограмм в условиях компьютерного анализа
позволяет четко отделить возбудителей холеры от остальных изучаемых вариантов
(свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2013620585
"Белковые профили масс-спектров представителей вида Vibrio cholerae").
В настоящее время нами проводится работа по
биохимическому анализу протеома штаммов эшерихий на основе создания виртуальных
коллекций. Нами установлены маркерные пики белков, отличающие гемолитическую
(вирулентную) популяцию от негемолитической, а так же комплекс белков,
характеризующих кишечные палочки, живущие в ассоциации с условно патогенными
бактериями. Нами установлено, что значение внутри вида 100% пика с масс –
зарядом, равным 9000 Да, может служить дифференциальным признаком
гемолитических эшерихий при масс – спектрометрическом типировании. Появление
гемолитических эшерихий в составе микрофлоры можно рассматривать как индикатор,
реагирующий на изменение гомеостаза хозяина. С этих позиций, совершенствование
дифференциальной диагностики гемолитических эшерихий масс – спектрометрическим
методом, с помощью выявленных нами таксономических протеомных маркеров, будет
полезным для создания диагностики и прогнозирования группы риска условно
здоровых людей для профилактики заболеваний желчевыводящих путей и
пищеварительной системы. Таким образом, создание коллекций виртуальных профилей
различных объектов раскрывает возможности более тонкого и точного анализа
различий в белковых фракциях изучаемых объектов, сходных с результатами
секвенирования рибосомальных РНК и возможности применения изменений в
транслируемой последовательности РНК для диагностических целей не имея "на
руках" живых микроорганизмов.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Лебедев А.Т.
Основы масс-спектрометрии белков и пептидов. – М. Техносфера, 2012 г.
2.
Телесманич
Н.Р., Агафонова В.В., Чемисова О.С., Чайка И.А., Водопьянов О.С. Протеомный
масс-спектрометрический анализ и типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных на территориях Российской
Федерации в 2010-2012 гг. ЖМЭИ, 2014. № 2: С.97-99.
3.
Телесманич
Н.Р., Чайка С.О., Водяницкая С.Ю., Чемисова О.С., Чайка И.А. Применение
масс-спектрометрического метода MALDI-TOF для межвидовой
дифференциации близкородственных вибрионов. Клиническая лабораторная
диагностика, том 59, № 8, 2014 г.
4.
Н.Р.
Телесманич, В.В. Агафонова, И.А. Чайка, С.О. Сеина и др. MALDI масс-спектрометрический анализ в типировании
и межвидовой дифференциации холерных вибрионов на основе создания
референс-библиотеки. Медицинский вестник Юга России, № 2, 2014 г.
5.
Кубанова А.А.,
Говорун В.М., Ильина Е.Н., Верещагин В.А., Фриго Н.В., Припутневич Т.В. Первый
опыт применения метода прямого белкового профилирования для идентификации и
типирования N. gonorrhoeae // Вестник дерматологии и венерологии.