Кравченко А. М., Чорногор Н. П., Тимчук О. А., Вінніков А. І.

Дніпропетровський національний університет

Виділення та характеристика азотфіксаторів

Питання про виділення азотфіксуючих бактерій в чистій культурі із місць їх природного існування не новий, але враховуючи вплив процесів азотфіксації на врожайність сільськогосподарських рослин він заслуговує серйозної уваги.

В зв’язку з цим нами проведено пошук та виділення азотфіксаторів для створення на їх основі перспективних препаратів комплексної дії для сільськогосподарських рослин.

Метою даної роботи було виділення та вивчення морфолого-культуральних і фізіологічних властивостей виділених ґрунтових ізолятів, які приймають участь у фіксації азоту. Для виконання поставленої мети проводили відбір вільноживучих та симбіотичних штамів азотфіксаторів за різними методами.

Для виявлення азотобактера використовували 10 зразків ґрунтів. Бульбочкові бактерії виділяли з бульбочок бобових рослин, які були вирощені в лабораторних умовах, в чорноземному ґрунті, який поширений у центральному регіоні України (м. Дніпропетровськ).

Для виявлення азотфіксуючих мікроорганізмів використовували висів, розведення ґрунтової витяжки та наступні щільні поживні середовища: бобовий агар, середовище Ешбі

Культивування виділених мікроорганізмів на вказаних середовищах здійснювали в стаціонарних умовах у термостаті при температурі + 28 ºС або на качалці 220 об/хв протягом 4-6 діб.

Виділення азотобактера проводили методом ґрунтових грудочок на середовищі Ешбі та методом ґрунтових пластинок.

Виявили, що практично у всіх дослідних чашках на ґрунтових грудочках утворювалися слизові колонії. Але час їх утворення коливався від 4 до 7 діб.

Всі колонії мали округлу форму. Розмір колоній коливався від 0,3 до 1,5 см. Поверхня рівна, структура однорідна, консистенція слизиста, колонії мали прозорий без кольору з блиском вигляд. Окремі колонії утворювали пігмент чорного, жовтого та бурого кольору.

Слизові колонії служили джерелом виділення чистих культур азотфіксаторів.

Проводили визначення морфолого-культуральних та біохімічних властивостей ізолятів. Мікроскопія клітин дозволила нам відібрати ізоляти схожі за своїми морфологічними ознаками до клітин бактерій азотобактера.

Всі ізольовані колонії були досліджено за основними диференціально-діагностичними ознаками. Дослідження культурально-фізіологічних властивостей показало, що це великі, паличкоподібної або овальної форми клітини, але морфологія їх може змінюватися в залежності від віку клітин та умов культивування. Клітини Грамнегативні, ендоспор не утворювали, рухливі, каталазопозитивні і часто утворювали пари. Відмічено наявність великої кількості капсульного слизу.

Деякі штами синтезували водорозчинний пігмент, який давав зелену флуоресценцію. Виділені ізоляти росли при 20-30 ºС і рН 4,5-9,0, але оптимальна температура складала 28 ºС при оптимумі рh 7,0-7,5.

Відомо, що виділені чисті культури були здатні використовувати D-глюкозу і D-мальтозу, що є важливим для ідентифікації азотобактера.

З коріння сої, гороху та конюшини виділяли бульбочкові бактерії. В результаті проведених дослідів з бульбочок було виділено 85 штами бульбочкових бактерій.

Мікроскопічний аналіз яких показав, що вони складаються з паличкоподібних клітин, рухливі, ендоспор не утворюють, утворюють капсулярний слиз, каталазопозитивні, желатину не розріджують.

Показано, що всі 85 виділених штамів з бульбочок різних бобових рослин не росли на м'ясопептонному агарі МПА, змінювали реакцію лакмусового молока на лужну. За інтенсивністю росту на агаризованому бобовому середовищі досліджувані штами об'єднані нами у дві групи. До першої групи нами було віднесено штами з інтенсивним ростом (5 штамі), що складало 34 % від всіх виділених штамів, які на 4-ту добу утворювали великі напівпрозорі колонії з матовим відтінком, до другої групи ‑ 20 штамів, з повільним ростом (66 % від всіх ізольованих штамів), які на 10-ту добу також утворювали дрібні колонії білого кольору. Різниця між штамами спостерігалася і у морфології клітин та їх розмірі, свідченням чого є мікроскопічні дослідження. Так перший тип був значно крупніший ніж другий тип (0,6-0,7 х 2,7-3,6 мкм, проти 0,7-0,8 х 1,5-1,9 мкм у клітин другого типу).

Порівняльний аналіз культуральних властивостей виділених штамів показав існування певної залежності між інтенсивністю росту культур і здатністю використовувати вуглеводи. Всі дослідні штами росли на середовищах з глюкозою, галактозою, манітом та арабінозою, але різнилися за здатністю використовувати сахарозу. Встановлено, що штами з інтенсивним ростом засвоювали сахарозу, в той час як штами з повільним ростом не росли на середовищі з сахарозою.

Представляло інтерес визначення чутливості до різних антибіотичних речовин. Антагоністичну активність визначали за диско-дифузійним та методом агарових блоків. Контроль зон затримки росту дослідних культур бульбочкових бактерій.

Виявлено, що дослідні культури бульбочкових бактерій різнилися за ознакою чутливості до різних антибіотиків. Штами з інтенсивним ростом виявляли чутливість до гентаміцину, норфлоксацину, еритроміцину, ципрофлоксацину, левоміцетину, канамінину та цефотаксину, в той час як повільнорослі штами виявляли резистентність до вище вказаних антибіотиків.

В зв’язку з перспективою створення на основі стрептоміцету та виділених штамів Azotobacter та Rhizobium біодобрива, комплексної дії, представляло інтерес визначення антагоністичних властивостей стрептоміцету. Антагоністичну активність по відношенню до дослідних штамів азотфіксуючих бактерій визначали за методом агарових блоків.

Крім того в якості антагоністів використовували 2 культури Streptomyces recifensis var. lyticus (шт. П-29 та шт. 2-Р15) Контролювали наявність зон пригнічення росту азотфіксуючих бактерій. Streptomyces recifensis var. lyticus антагоністичною дією по відношенню до Azotobacter та Rhizobium з повільним ростом не володіють, про що свідчить відсутність зон затримки росту культур азотфіксуючих бактерій. Але володіє по відношенню до штамів Rhizobium з інтенсивним ростом.

З різних зразків ґрунту виділили 10 чистих культур, які за цими ознаками належали до роду Azotobacter

З бульбочок сої, гороху та конюшини виділено та досліджено суттєві диференціально-діагностичні ознаки 85 ізолятів, які володіли систематичними ознаками характерними для бактерій роду Rhizobium.

Враховуючі досліджені морфолого-культуральні та фізіологічні властивості виділених ізолятів можна зробити висновок про те, що чисті культури Azotobacter та Rhizobium можуть використовуватися для створення біологічно активних препаратів для сільського господарства.