Медицина/6

Медицина/6. Экспериментальная и клиническая фармакология.

Шокур О. А.

Изменение агрегации тромбоцитов in vitro под влиянием пектинов и альгината

Тихоокеанский государственный медицинский университет, г. Владивосток,

Актуальной задачей экспериментальной фармакологии является поиск новых средств для лечения заболеваний, связанных с нарушением поддержания гомеостаза: патологий свертывания крови, тромботических осложнений сердечно-сосудистых заболеваний. Тромбоциты выступают в качестве важнейших посредников в поддержании гомеостаза кровеносной системы, и их активация жестко регулируется в условиях физиологической нормы. В первичном тромбоцитарно-сосудистом гемостазе выделяют этапы реакций, направленных на образование тромба: адгезию, распластывание, реакцию высвобождения, агрегацию и ретракцию. Важным показателем при оценке сосудисто-тромбоцитарного гемостаза является характер изменения спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов. Наиболее достоверный метод оценки сосудисто-тромбоцитарного гемостаза заключаются в исследовании степени агрегации тромбоцитов. Перспективными соединениями для создания фармацевтических субстанций могут стать некрахмальные полисахариды, обладающие широким спектром фармакологических эффектов.

Цель настоящего исследования состояла в оценке агрегационной активности некрахмальных полисахаридов: пектинов и альгината натрия.

В работе использовали коммерческий альгинат натрия («High Quality Pharma», Франция), цитрусовый высокоэтерифицированный пектин (Herbstreith&Fox KG, Германия), и низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации 9,6%, полученный путем щелочной деэтерификации (Ковалев, 2004).

Исследование агрегации тромбоцитов проводили на двухканальном лазерном анализаторе агрегации 230LA (НПФ "БИОЛА", Россия) на основании как световой агрегатометрии (Born G.V.R. 1962.), так и анализа флуктуаций светового потока (Gabbasov Z.A., 1989). Образование агрегатов большого размера (свыше 100 клеток) оценивали методом световой агрегатометрии по Борну в ответ на высокие дозы индуктора АДФ в конечной концентрации 5 мкМ (НПО «Ренам»). Способность тромбоцитов к образованию агрегатов малого размера (менее 50-100 клеток) изучали на основе анализа кривой спонтанной агрегации (Gabbasov Z.A., 1989). Полисахариды в различных концентрациях добавляли к плазме за 5 мин до внесения индуцирующего агента. Процесс образования агрегатов визуализировали графически. По кривой светопропускания и по кривой среднего размера агрегатов оценивали степень агрегации тромбоцитов. Для спонтанной агрегации степень агрегации определяли как максимальное значение среднего размера агрегатов, и измеряли в относительных единицах (у.е.). Для индуцированной агрегации степень агрегации определяли как максимальное приращение светопропускания после добавления индуктора, и измеряли в процентах (%). Исследование проводили на образцах обогащенной тромбоцитами плазмы практически здоровых добровольцев.

Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием статистической программы Instat (Graph Pad Software Inc. USA, 2005). Различия между связанными группами проводили с использованием критерия Фридмана, с последующим проведением апостериорных сравнений с помощью непараметрического критерия Вилкоксона для парных выборок. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Исследование спонтанной агрегации тромбоцитов при внесении растворов полисахаридов выявило их способность образовывать агрегаты малого размера (см. табл. 1, 2, 3). Так, при концентрации высокоэтерифицированного пектина 0,05 мг/мл степень агрегации повышалась в 2,3 раза, а в дозе 0,125 и 0,25 мг/мл – в 2,7 и 3,8 раз, соответственно. Под влиянием низкоэтерифицированного пектина со степенью этерификации 9,6% уровень агрегации повышался, но в меньшей степени, чем под влиянием высокоэтерифицированного пектина. Пектин со степенью этерификации 9,6% в концентрации 0,05 мг/мл повышал степень агрегации в 1,4 раза, при концентрации 0,125 мг/мл – в 1,5, а при концентрации 0,25 мг/мл – в 3,6 раз. Низкие концентрации раствора альгината натрия вызывали бóльшее повышение агрегации по сравнению с пектинами. Альгинат в концентрации 0,05 мг/мл достоверно повышал степень агрегации в 2,7 раз, а в дозе 0,125 мг/мл – в 4 раза, повышение дозировки до 0,25 мг/мл вызывало незначительное повышение агрегации и было недостоверным. Это может быть связано с тем, что рабочий диапазон концентраций альгината натрия составляет 0,05-0,125 мг/мл. Таким образом, независимо от используемого полисахарида происходило повышение агрегации, но количество клеток в агрегатах не превышало 10.

Таблица 1. Степень спонтанной агрегации тромбоцитов под влиянием растворов цитрусового высокоэтерифицированного пектина

Конечная концентрация пектина, (мг/мл)	Степень агрегации, у.е.	W (n=9)	Р
0 (контроль)	2,47 (2,02; 3,015)
0,05	5,73 (3,76; 11,75)*	0	0,0039
0,125	6,76 (3,71; 10,95)*	0	0,0039
0,25	9,44 (3,11; 12,03)*	0	0,0039

Здесь и в табл. 2, 3: *Достоверное отличие (p < 0,05) по сравнению с контролем. W – значение критерия Вилкоксона, n – объем выборки. Данные представлены в виде медианы (Ме) и значений квартильного диапазона (25%; 75%).

Таблица 2. Степень спонтанной агрегации тромбоцитов под влиянием растворов низкоэтерифицированного пектина со степенью этерификации 9,6%

Конечная концентрация пектина, (мг/мл)	Степень агрегации, у.е.	W (n=9)	Р
0 (контроль)	2,74 (2,02; 3,75)
0,05	3,8 (3,1; 7,14)*	3	0,0195
0,125	4,12 (2,94; 6,99)*	5	0,0391
0,25	9,89 (2,24; 14,2)*	4	0,0273

Таблица 3. Степень спонтанной агрегации тромбоцитов под влиянием растворов альгината натрия

Конечная концентрация альгината натрия, (мг/мл)	Степень агрегации, у.е.	W (n=13)	Р
0 (контроль)	2,58 (1,96; 5,26)
0,05	7,05 (3,75; 11,35)*	7	0,046
0,125	10,30 (2,73; 21,2)*	5	0,0024
0,25	4,79 (3,31; 2,87)	0	0,0625

АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов под действием как альгината натрия, так и пектинов не изменялась: различия не были статистически значимыми.

Проведенные эксперименты показали, что растительные высокомолекулярные несульфатированные полисахариды обладают незначительной дозозависимой проагрегантной активностью in vitro, при этом исследуемые полисахариды не вызывают достоверно значимых изменений АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.

Литература:

Ковалев В.В. Сравнительная оценка металлсвязывающей активности низкоэтерифицированных и высокоэтерифицированных пектинов: Дис. … канд. биол. наук. Владивосток. 2004. – 133 с.

Born G.V.R. Quantitative investigation into the aggregation of blood platelets // J. Physiol. 1962. Vol. 162. P. 67–68.

Gabbasov Z.A., Popov E.G., Gavrilov I.Yu., Posin E.Ya. Platelet aggregation: the use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension // Thrombosis Research. 1989. Vol. 54. No. 3. P. 215–223.