Биологические науки/9. Биохимия и биофизика

Д.б.н. Князева О.А., к.с-х.н. Князев А.В.

*Башкирский государственный медицинский университет,

**Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Россия

Исследование аффинности моноклональных

антител и получение иммуносорбентов для

выделения подклассов IgG человека

Для выделения подклассов IgG человека часто используют ионообменную хроматографию белков сыворотки крови больных с миеломой. При этом возникают проблемы, связанные с низкой встречаемостью миеломной болезни (1:100000 человек/год; среднее распределение парапротеинов IgG по подклассам: IgG1 – 75% , IgG2 – 13% , IgG3 – 8% и IgG4 – 4%). Усложняет проблему еще и то, что, во-первых, не всегда возможно с помощью ионообменной хроматографии полностью очистить необходимый белок от примесей других подклассов, во-вторых, при использовании ионообменной хроматографии неизбежны большие потери: теряется малорастворимая фракция иммуноглобулинов и часть молекул остается связанной с ионообменником из-за гетерогенности их изоэлектических точек (диапазон рI находится в интервале от 5,0 до 9,5). Кроме того, для снятия антигена с иммуносорбента обычно применяют буферные растворы с высокой молярностью соли или низким значением рН, что приводит к необратимым конформационным изменениям IgG, которые делают препарат непригодным для последующих исследований. В связи с этим, выделение отдельных подклассов из поликлональной фракции IgG является актуальной и перспективной задачей.

Для создания иммуносорбентов на основе МкАТ необходимы высокоаффинные антитела. Нами был использован метод, позволяющий проводить исследование аффинности без предварительной очистки МкАТ, т.е. непосредственно в асцитической жидкости.

Вся процедура определения представляла собой серию опытов, состоящую из трех этапов. На первом этапе методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) определяли оптимальное значение посадочной концентрации антигена, составляющее примерно 80% от концентрации, при которой наступает насыщение, т.е. значение экстинкции практически не меняющееся при дальнейшем увеличении концентрации антигена и постоянной концентрации МкАТ.

На втором этапе таким же образом определяли оптимальное значение концентрации МкАТ при оптимальной концентрации антигена. На третьем этапе, после сенсибилизации лунок планшета антигеном в оптимальной концентрации, вносили исследуемые МкАТ в смеси с соответствующим антигеном (в концентрации, возрастающей от 0,5 до 5,0 мкг/мл). Далее, как обычно, вносили конъюгат кроличьих антител против IgG мыши с пероксидазой в рабочем разведении и после инкубации – субстрат (ортофенилендиамин в 0,05 М цитратном буфере с добавлением перекиси водорода). Результаты в единицах экстинкции регистрировали при длине волны 405 нм, оптическом пути 3 мм.

Определение константы диссоциации (Кd) комплекса [МкАТ-АГ] проводили, исходя из уравнения: Ао/(Ао – А) = 1 + Кd/а, где а – концентрация вносимого вместе с МкАТ антигена в моль/л, Ао – экстинкция при а = 0, А – экстинкция, регистрируемая в опыте.

Строя зависимость Ао/(Ао – А) от 1/а, получали прямую, тангенс угла наклона которой равнялся искомой Кd.

Для создания иммуносорбентов были отобраны высокоаффинные МкАТ, взаимодействующие с тремя из четырех подклассов: A5B8 (против IgG 1,3,4; Кd =3,21±0,35·10^-8), 2G11 (против IgG 1,2,4; Кd =3,68±0,21·10^-8) и Л2H2 (против IgG 1,2,3; Kd=1,17±0,13·10^-8) [1, 3, 2].

Иммуносорбенты на основе двух первых МкАТ получали перйодатным методом, заключающемся в том, что отжатую CL 4B сефарозу (Sph) окисляли в темноте в течение часа в 0,1 М растворе перйодата натрия, многократно отмывали, добавляли гидразингидрат в 0,1 М натрий-ацетатном буфере и инкубировали на шейкере в течение 15 часов при комнатной температуре. МкАТ готовили подобным образом и смешивали с Sph в течение суток при комнатной температуре на шейкере. Для Sph-Л2Н2 была использована более мягкая методика, отличающаяся от первой тем, что перйодатом окисляли только сефарозу, иммобилизацию антител на матрице проводили при рН 9,5 и без гидразингидрата.

Полученные иммуносорбенты были опробованы при выделении подклассов из поликлональной фракции IgG. Тестирование проводили с помощью ИФА, используя мышиные МкАТ против IgG1 IgG2, IgG3, IgG4 и конъюгат МкАТ 2F11E11 [4] с пероксидазой.

Таким образом, на основе высокоаффинных МкАТ возможно создание иммуносорбентов для аффинного выделения подклассов IgG из пула иммуноглобулинов при физиологических значениях рН (~ 7,4) и ионной силе раствора.

Литература

1. Патент РФ № 2002803, МКИ⁵ С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG1,3,4 человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева. – Опубл. 15.11.93. Бюл. 1993, № 41-42.

2. Патент РФ № 2008350, МКИ⁵ С 12 N 5/00, С 12 Р 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева. – Опубл. 28.02.94. Бюл. 1994, № 4.

3. Патент РФ № 2003679, МКИ⁵ С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG1,2,3 человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева, Г.В. Троицкий. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.

4. Патент РФ № 2010856, МКИ⁵ С 12 N 5/00, C 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к IgG человека / О. А. Князева, К. А. Ефетов, С. Ю. Тэтин, Г. В. Троицкий. – Опубл. 15.04.94. Бюл. 1994, № 7.