Жаркова Л.П.^1,2, Князева И.Р.³, Иванов В.В.³, Кутенков О.П.², Ростов В.В.², Большаков М.А.^1,2

¹Томский государственный университет, Россия

²Институт сильноточной электроники СО РАН, Россия

³Сибирский государственный медицинский университет, Россия

Влияние НАНОСЕКУНДНого импульсно-периодического миковолнового излучения на ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ митохондрий печени мышей

Одним из возможных механизмов влияния импульсно-периодического микроволнового излучения (ИПМИ) с импульсами наносекундной длительности может быть изменение уровня активных форм кислорода (АФК) с последующей окислительной модификацией липидов и белков клеток [1]. В результате окислительной модификации фосфолипидного бислоя могут изменяться физико-химические свойства биологических мембран и ионные потоки через них. Это будет затрагивать функциональное состояние митохондрий, прежде всего, интенсивность работы дыхательной цепи. Изменение ионных потоков в митохондриях под воздействием ИПМИ должно приводить к изменению их объёма, поскольку накопление или обеднение матрикса органелл теми или иными ионами сопровождается переносом молекул воды в него или из него соответственно. Поэтому, измеряя интенсивность дыхания и изменение объема митохондрий, можно оценить действия импульсных микроволн на митохондрии как первичные мишени биологического действия исследуемого излучения.

Целью настоящего исследования являлось изучение влияния наносекундного импульсно-периодического микроволнового излучения на скорость потребления кислорода изолированными митохондриями в различных метаболических состояниях и на изменение объема этих органелл.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Эксперименты выполнены на препаратах интактных митохондрий, полученных стандартным методом дифференциального центрифугирования из печени беспородных белых мышей-самцов [2]. Содержание животных и все манипуляции с ними проводились в соответствие с общепринятыми этическими нормами и правилами [3].

Изолированные митохондрии подвергались однократному воздействию 4000 микроволновых импульсов с частотами повторения в диапазоне 8 – 22 имп./с. В работе сравнивались показатели дыхания и набухания митохондрий, облученных ИПМИ и ложнооблученных (подвергавшихся аналогичным манипуляциям, что и облученные, но без включения источника излучения). Источником ИПМИ служил лабораторный импульсный генератор на основе магнетрона МИ-505 (Россия, несущая частота 10 ГГц, выходная пиковая мощность 180 кВт, длительность импульсов 100 нс). Облучение проводилось из открытого конца волновода сечением 10 × 33 мм. Интенсивность воздействия оценивалась по величине пиковой плотности потока мощности, которая в данном исследовании составляла от 70 до 1500 Вт/см².

Дыхание митохондрий определялось по скорости потребления кислорода. Для этого использовался измеритель кислорода АКПМ-02Л (Россия), снабженный амперометрическим сенсором АСрО₂-01 (Россия) и полярографическая ячейка объемом 1.3 мл. Среда инкубации содержала 250 мМ сахарозы, 2.5 мМ МgCl₂, 5 мМ КН₂РО₄ (рН 7.4) и 1,0 мг/ мл белка митохондрий. В качестве экзогенного энергетического субстрата использовался сукцинат (5 мМ). Скорость дыхания выражалась в нмоль О₂/мин на мг белка. Содержание белка в пробах суспензии митохондрий определялось по Бредфорду [4]. Скорость потребления кислорода изолированными митохондриями определялась в различных состояниях по Чансу [5]. Для оценки эффективности работы дыхательной цепи рассчитывался дыхательный коэффициент (отношение скоростей фосфорилирующего и нефосфорилирующего дыхания), по величине которого можно судить о степени сопряженности процессов окисления и фосфорилирования, а также о степени интактности митохондриальных препаратов [5].

Изменение объема митохондрий в суспензии после облучения ИПМИ регистрировалось с помощью спектрофотометра СФ 103 (Россия) по изменению оптической плотности пробы при длине волны 540 нм. Состав среды инкубации и содержание в ней митохондрий были такими же, как и в экспериментах с измерением дыхания. Регистрация набухания проводилась после добавления в качестве экзогенного субстрата 5 мМ сукцината. Для измерения скорости набухания митохондрий в присутствии ионов Ca²⁺ в инкубационную среду сразу после воздействия ИПМИ добавлялся раствор CaCl₂ в конечной концентрации 200 нмоль/мг белка.

Выборки использованных показателей для каждого из режимов воздействия получались из экспериментальных данных в 6 повторностях. Измеренные показатели анализировались в виде средней арифметической величины показателя и её стандартной ошибки. Статистическая значимость различий между показателями облученных и ложнооблученных выборок определялась с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни с использованием пакета программ Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Дыхание митохондрий было оценено по скорости потребления кислорода в разных метаболических состояниях: дыхание на эндогенных субстратах (V0); в присутствии в среде инкубации 5 мМ сукцината (V2); фосфорилирущее дыхание в присутствии 200 мкМ АДФ (V3). После облучения суспензии митохондрий ИПМИ с пППМ 70, 700 и 1500 Вт/см² выяснилось, что скорость потребления кислорода митохондриями на эндогенных субстратах (в метаболическом состоянии 1 по Чансу) не изменялась после воздействия импульсно-периодического микроволнового излучения всех используемых интенсивностей и частот повторения импульсов.

Добавление к суспензии облученных органелл сукцината (5 мМ) переводило митохондрии в состояние 2, в результате чего скорость потребления кислорода после воздействия ИПМИ с пППМ 70 Вт/см² при частотах 8 и 13 имп./с, с пППМ 700 Вт/см² при частотах 8 и 22 за секунду и с пППМ 1500 Вт/см² при частоте 22 имп./с. повышалась до двух раз по отношению к группе ложного облучения Облученние митохондрий ИПМИ с остальными параметрами оказалось неэффективным в отношении изменения скорости потребления кислорода в состоянии 2 в присутствии экзогенного субстрата сукцината и в отсутствие синтеза АТФ (рисунок 1).

Рисунок 1 – Влияние импульсно-периодического микроволнового излучения с пиковой плотностью потока мощности 70, 700 и 1500 Вт/см² и частотами повторения 8–22 имп./с на скорость потребления кислорода митохондриями после добавления экзогенного субстрата дыхания сукцината (в метаболическом состоянии 2 по Чансу). Штриховой полосой обозначен 95% доверительный интервал значений для группы ложного облучения; * – различия между показателями облученной и ложнооблученной выборок статистически значимы с уровнем р ≤ 0,05

Коэффициент дыхательного контроля, отображающий степень сопряжения процессов окисления и фосфорилирования после воздействия микроволновых импульсов увеличивается только после воздействия с пППМ 1500 Вт/см² с частотой повторения 10 имп./с (рисунок 2). Во всех остальных случаях дыхательный коэффициент либо не изменялся (в большинстве из облученных групп), либо значимо снижался, как после воздействия с интенсивностью 70 Вт/см² при частотах 8, 10 и 13 имп./с, а также после воздействия с пППМ 700 Вт/см² при частоте 8 имп./с (рисунок 2). Снижение уровня дыхательного коэффициента свидетельствует о разобщении процессов окисления и фосфорилирования. Поэтому даже на фоне стимуляции дыхания может наблюдаться снижение продукции АТФ.

Рисунок 2 – Изменение величины коэффициента дыхательного контроля после воздействия импульсно-периодического микроволнового излучения с пиковой плотностью потока мощности 70, 700 и 1500 Вт/см² и частотой повторения 8–22 имп./с. Обозначения аналогичны рисунку 1.

Изменение функционального состояния митохондрий после воздействия ИПМИ должно сопровождаться изменением ионных потоков через мембрану. В свою очередь, это должно приводить к изменению их объёма. Изменение объёма митохондрий приводит к изменению светопропускания суспензии органелл [6-9]. Регистрация изменения объема митохондрий в среде, содержащей ионы Ca²⁺, позволяет оценить изменение чувствительности неспецифической проницаемости митохондрий в ответ на действие различных факторов [7].

На рисунке 3 представлены типичные кривые регистрации набухания митохондрий по изменению оптической плотности суспензии органелл после воздействия ИПМИ. Для унификации оценивания эффекта воздействия, показатели изменения объёма митохондрий регистрировались через 5 мин после прекращения облучения и, соответственно, через 5 мин после добавления ионов Ca²⁺, которое осуществлялось сразу же после прекращения облучения.

Рисунок 3 – Типичные кривые регистрации изменения оптической плотности суспензии изолированных митохондрий печени мышей после воздействия: А – в среде без ионов Ca²⁺, Б – с добавлением ионов Са²⁺ (200 нмоль/мг белка) (подробности в тексте).

После облучения митохондрий ИПМИ с пППМ 70, 700 и 1500 Вт/см² при всех использованных частотах повторения импульсов изменений оптической плотности энергизованных (с 5 мМ сукцината) митохондрий в среде без ионов Са²⁺ не наблюдалось (рисунок 4, А). Это указывало на отсутствие существенного изменения объема митохондрий и означает, что изменения ионных потоков не происходило, либо потоки изменялись, но суммарный баланс переноса зарядов сохранялся.

При измерении индуцированного ионами Ca²⁺ набухания облученных митохондрий наблюдался иной эффект. После воздействия ИПМИ с пППМ 70 Вт/см² при всех использованных частотах оптическая плотность суспензии энергизованных митохондрий (дыхание на экзогенном субстрате) повышалась относительно ложнооблученных образцов (рисунок 4, Б). Это означало, что такое воздействие приводит к снижению чувствительности неспецифической проницаемости митохондрий, индуцированной ионами Ca²⁺. Более интенсивное воздействие ИПМИ (700 Вт/см²) с частотами повторения 10 и 16 имп./с, наоборот, сопровождалось уменьшением оптической плотности облученной суспензии. Это может быть результатом того, что после воздействия с таким режимом повышается чувствительность неспецифической проницаемости митохондрий к ионам Ca²⁺ и происходит более раннее открытие пор неспецифической проницаемости, в органеллы поступает вода и митохондрии быстрее набухают. Воздействие ИПМИ с интенсивностью 1500 Вт/см² при всех использованных частотах повторения импульсов значимо не меняло оптическую плотность, и, соответственно, объем митохондрий в среде с Ca²⁺ по сравнению с ложнооблученными образцами.

Б

А

Б

А

Рисунок 4 – Изменение оптической плотности суспензии митохондрий на 5-й минуте после воздействия ИПМИ с пППМ 70, 700 и 1500 Вт/см² и частотами повторения импульсов 10, 13, 16 и 22 имп./с в среде инкубации: А – в среде без Ca²⁺, Б – с добавлением Са²⁺ (200 нмоль/мг белка). Обозначения аналогичны рисунку 1.

Заключение

Выполненные эксперименты показали, что воздействие 4000 импульсов ИПМИ может изменять скорость дыхания митохондрий. Наиболее эффективно ускорялось дыхание после воздействий с частотами повторения 8, 10 и 22 имп./с при интенсивностях 70 и 700 Вт/см². В этих случаях величина коэффициента дыхательного контроля уменьшалась, что определенно указывает на ухудшение функционального состояния митохондрий с точки зрения уменьшения степени сопряжения окисления и фосфорилирования и снижения возможности продукции АТФ. Известно [10], что разобщение окисления и фосфорилирования определяется, в первую очередь, состоянием внутренней мембраны митохондрий, характеризуемое изменением ее проницаемости, как для протонов, так и для других ионов с соответствующим набуханием этих органелл. Поэтому, наблюдавшееся изменение объема митохондрий подтверждает влияние наносекундного ИПМИ на функциональное состояние митохондрий.

Набухание митохондрий после воздействия может быть связано с активацией перекисного окисления липидов (ПОЛ), в результате чего происходит образование перекисей жирных кислот фосфолипидов мембран митохондрий и увеличение проницаемости внутренней мембраны митохондрий для протонов и других ионов [10]. Однако, существенного нарушения фосфолипидного слоя мембран и связанного с этим изменения ионных потоков и воды, по-видимому, не происходит, поскольку в отсутствие Ca²⁺ в среде изменения объема митохондрий не отмечается. Другим механизмом, также приводящим к повреждению митохондрий, может быть индукция поры неспецифической проницаемости на внутренней мембране. АФК в определенных условиях могут потенцировать открытие поры, поэтому эти два механизма обычно взаимосвязаны [7]. Ранее было показано, что воздействие ИПМИ на митохондрии приводит к изменению уровня одной из АФК, пероксида водорода, в этих органеллах [11]. Поскольку эффекты изменения объема митохондрий после облучения в отсутствии и при наличии ионов кальция в среде существенно различаются, это указывает на важную роль этого иона в реагировании митохондрий на воздействие, по-видимому, за счет изменения чувствительности поры неспецифической проницаемости. В свое время W.R. Adey [12] указал на важную роль ионов кальция в формировании эффектов модулированных радиочастотных излучений. Применительно к митохондриям известно, что Са²⁺ оказывают двойственное действие [13]. С одной стороны Са²⁺ стимулирует окислительное фосфорилирование [14], также стимулируют АТФ-синтазу [15], а с другой стороны, высокие концентрации ионов Са²⁺ открывают в митохондриях поры неспецифической проницаемости, что приводит к удалению адениновых нуклеотидов из митохондрий [16] и их набуханию.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что ИПМИ с импульсами наносекундной длительности оказывают влияние на функционирование митохондрий. Поскольку эти органеллы играют важную роль в поддержании кальциевого гомеостаза клетки [17], можно предполагать что воздействие ИПМИ, изменяя уровень АФК в изолированных митохондриях, оказывает влияние на чувствительность неспецифических пор проницаемости мембран органелл и могут модулировать опосредуемые ионами Са²⁺сигнальные пути в клетках.

Работа финансово поддержана Аналитической ведомственной целевой программой «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 и 2011)»; проекты № 2.1.1/2777 и № 2.1.1/13778

Литература:

1. Bolshakov M.A., Knyazeva I.R., Rostov V.V., et al. Initiation of free-radical oxidation in albino mice by exposure to pulse periodic microwaves and x-rays // Biophysics, 2005. Vol. 50. Suppl. 1. PP. 104–109.

2. Pallotti F., Lenaz G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines// Methods Cell Biology. 2001. Vol. 65. PP. 1–35.

3. Euroguide on the accommodation and care of animals used for experimental and other scientific purposes. (Based on the revised Appendix A of the European Convention ETS 123) FELASA: Federation of European Laboratory Animal Science Associations, London, UK. 2007. 17 с. www.felasa.eu.

4. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 7, № 1. PP. 248-254.

5. Chance B., Williams G.R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen, utilization // Journal of Biological Chemistry. 1955. Vol. 217. PP. 383–393.

6. Николс Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию: Пер. с англ. М.: Мир, 1985. 190 с.

7. Оливьер П.Дж., Сантос М.С., Узллас К.В. Тиолзависимые изменения неспецифической проницаемости и дыхания митохондрий, вызываемые доксорубицином // Биохимия. 2006. Т. 71. № 2. С. 247–254.

8. Пазялова А.А. Влияние микотоксинов боверицина и энниатина на функциональные системы митохондрий//Известия ПГПУ. 2007. №3. С. 300–307

9. Crichton P.G., Parker N., Vidal-Puing A.J., et al. Not all mitochondrial carrier proteins support permeability transition pore formation: no involvement of uncoupling protein1 // Bioscience reports. 2009. V. 30(3). P. 187–192.

10. Брайловская И.В., Старков А.А., Мохова Е.Н. Индукция Ca²⁺-зависимой поры в митохондриях печени под действием аскорбата в присутствии низких концентраций ионов железа // Биохимия. 2001. Т. 66. № 8. С. 1117–1121.

11. Жаркова Л.П., Князева И.Р., Иванов В.В., с соавт. Влияние импульсно-периодического рентгеновского и микроволнового излучений на уровень перекисей в изолированных гепатоцитах // Вестник Томского государственного университета. 2010. № 333. С. 161–163.

12. Adey W.R. Tissue interaction with nonionising electomagnetic fields // Physiology Review. 1981. V. 61(2). PP. 435–514.

13. Brookes P.S., Yoon Y., Robotham J.L., et al. Calcium, ATP, and ROS; a mitochondrial love-hate triangle // American Journal of Physiology. Cell Physiology. 2004. V. 287. PP. 817–833.

14. McCormack J.G., Denton R.M. Mitochondrial Ca²⁺ transport and the role of intramitochondrial Ca²⁺ in the regulation of energy metabolism. // Dev Neuroscience. 1993. V. 15. PP.165–173.

15. Mildaziene V., Baniene R., Nauciene Z., et al. Calcium indirectly increases the control exerted by the adenine nucleotide translocator over 2-oxoglutarate oxidation in rat heart mitochondria. // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1995. V. 324. PP. 130–134.

16. Halestrap A.P., Brennerb C. The adenine nucleotide translocase: a central component of the mitochondrial permeability transition pore and key player in cell death // Current Medicinal Chemistry. 2003/ V. 10. PP. 1507–1525.

17. Gunter T.E., Yule D.I., Gunter K.K., et al. Calcium and mitochondria. // FEBS Letters. 2004. V. 567. PP. 96–102.