Экология / 6. Экологический мониторинг

к.х.н. Арляпов В.А., Юдина Н.Ю., к.х.н. Алферов С.В., к.х.н., Асулян Л.Д., к.х.н. Алферов В.А.

Тульский государственный университет, Россия

Разработка БПК-биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryomyces hansenii, иммобилизованного в химически-модифицированный поливиниловый спирт

 В настоящее время имеет место жесткое ограничение потребности человека в водных ресурсах. Масштабные объемы потребления воды для удовлетворения бытовых нужд, применение воды в технологических процессах приводит к истощению водных запасов и к острой необходимости производить регенерацию использованных объемов воды. Для оценки степени загрязненности воды органическими веществами применяется параметр, определенный как индекс биохимического потребления кислорода (БПК). Существующий стандартный метод определения БПК основан на тестах, минимальная продолжительность которых составляет 5 суток [1].

Альтернативой являются экспрессные  методы определения БПК с использованием биосенсорных анализаторов, основанные на применении микроорганизмов, способных метаболизировать широкий спектр органических соединений [2]. Принципиальным отличием данного метода от стандартного является сокращение времени анализа с 5 суток до 5 - 30 минут.

Перспективным направлением для исследований является изучение возможности применения биораспознающих элементов, которые позволят улучшить качество производимых измерений. В настоящей работе был использован дрожжевой штамм Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов УРАН ИБФМ им. Г.К. Скрябина. Согласно литературным данным дрожжи Debaryamyces hansenii обладают широкой субстратной специфичностью и способны окислять многие спирты, углеводы, аминокислоты и другие органические вещества, кроме того они устойчивы к высоким концентрациям солей [3].

В основу прибора для экспресс-анализа БПК положена биосенсорная установка амперометрического типа, интегрированная с персональным компьютером. Датчиками являются кислородные электроды с иммобилизованными клетками микроорганизмов. Иммобилизация микроорганизмов проводилась путем включения их в гель на основе поливинилового спирта, модифицированного в N-винилпирролидоном.

В работе была проведена оценка субстратной специфичности биосенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii  иммобилизованных в пленку ПВС модифицированную N-винилпирролидоном по 34 различным субстратам, относящимся различным классам органических соединений (рисунок 1).

Рис 1. Субстратная специфичность биосенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii  иммобилизованных в химически-модифицированный ПВС.

Иммобилизованные дрожжи Debaryamyces hansenii обладают наибольшей чувствительностью к этанолу – ответ на него был принят за 100%. Из представленной диаграммы видно что микроорганизмы Debaryamyces hansenii  окисляют все представленные классы органических соединений: спирты, углеводы, карбоновые кислоты, аминокислоты, нитрофенолы и поверхностно активные вещества, которые могут быть обнаружены в сточных водах. Это является перспективными с точки зрения возможности их использования для оценки БПК.

Были определены основные аналитические и метрологические характеристики разработанного биосенсора (Таблица 1).

Таблица 1. Характеристики разработанного БПК-биосенсора

Характеристика

Значение

Операционная стабильность, %

4,2

Долговременная стабильность, суток

20

Чувствительность, мин-1

0,0045

Время единичного измерения, мин

5-7

Диапазон определяемых значений БПК5, мг/дм3

0,7 - 206,7

За долговременную стабильность принималось время, в течение которого величина сигнала составляла не менее 25 % от начальной. Операционная стабильность сенсоров характеризовалась изменением ответа биосенсора после 15 последовательных измерений. Таким образом, биосенсор на основе микроорганизмов Debaryamyces hansenii  обладает высокой долговременной и операционной стабильностью.

Нижняя граница определяемых концентраций составила 0,7 мг/л, что сопоставимо с ПДК для БПК5 рыбхозяйственных водоемов. Время единичного анализа составляет не больше 7 минут, что показывает высокую экспрессность метода.

Изучено влияние негативных факторов (рН, ионой силы, соединений тяжелых металлов) на окислительную активность иммобилизованных дрожжей в биораспознающем элементе биосенсора. Максимальный ответ биосенсора на основе дрожжей D. hansenii наблюдается  в интервале рН 6,8-7,2. При увеличении ионной силы раствора в 8 раз происходит снижение ответов на 50% от первоначальных.

Для изучения ингибирующего действия соединений тяжелых металлов была исследована зависимость окислительной способности клеток штамма Debaryomyces hansenii от присутствия в растворе ионов Ni2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Hg3+, Cr3+    и Cr2O72- в диапазоне концентраций превышающих ПДК рыбхозяйственных водоемов в 10-100 раз. При превышении ПДК в 10 раз для всех исследуемых ионов тяжелых металлов, кроме Fe3+ и Pb2+, снижение ответов составляет не более 20%, что может свидетельствовать о стресс-устойчивости дрожжей Debaryomyces hansenii.

Был проведен анализ образцов сточных вод различного происхождения с использованием БПК-биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii и стандартным методом разбавления по ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Показано, что значения БПК, определенные с помощью биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii совпадают со значениями, полученными стандартным методом с учетом доверительных интервалов (R = 0,99).

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы, госконтракт № 16.512.11.2209.

Литература:

1.     ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. – М.: 1997, 25 с.

2.     Понаморева О.Н., Арляпов В.А., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода. // Прикладная биохимия и микробиология. Т.47. №1. 2011. с. 5-15.

3.     Понаморева О.Н. Арляпов В.А., Каманин С.С., Юдина Н.Ю., Алферов В.А. Биосенсор для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода на основе дрожжевых микроорганизмов родов Candida  и Debaryomyces. // Вестник биотехнологии. Т 6. № 3. 2010. с. 5 – 12.