Кухарская Т.А., к.б.н. Ерошевская Л.А., к.х.н. Кулак Т.И.*,

д.х.н. Калиниченко Е.Н.*, д.б.н. Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

*Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск

Факторы, влияющие на образование комплекса

(3'5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом

Spicaria violacea

 

(2'-5')-Олигоаденилаты общей формулы А(2'р5'А)n-1 [далее (2'-5')Аn] представляют собой олигонуклеотиды, состоящие из нескольких фрагментов аденозина, связанных между собой (2'-5')-фосфодиэфирной связью (рисунок).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок – Структурная формула тримера (2'-5')А3

 

Эти соединения обладают активностью против вирусов растений и животных [1−3]. При этом наибольшую биологическую активность проявляют три- и тетрамеры. Главными недостатками химических способов получения (2'-5')Аn является их сложность и многостадийность.

Ранее нами селектирован гриб Spicaria violacea, мицелий и фильтрат культуральной жидкости (КЖ) которого содержит фосфатазу и специфическую нуклеазу, способную гидролизовать (3'-5')-, но не (2'-5')- фосфодиэфирные связи [4]. Указанные свойства гриба могут позволить использовать его при химико-ферментативном получении (2'-5')Аn, основанном на избирательном гидролизе химически синтезированного полиаденилата, содержащего (3'-5')- и (2'-5')-межнуклеотидные фосфодиэфирные связи [5].

Цель настоящей работы состояла в подборе питательной среды, обеспечивающей высокий уровень рассматриваемого комплекса ферментов и изучении факторов, влияющих на его образование.

 

Объекты и методы исследования. В работе использовали штамм гриба Spicaria violacea БМ-105Д (далее S. violacea), хранящийся в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси. Для культивирования гриба в качестве исходной использовали среду Чапека. Для поддержания кислых значений рН среды в процессе роста гриба в нее вносили 0,4% молочной кислоты. Культивирование гриба проводили глубинным способом в колбах Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащих по 100 мл питательной среды, на биологической качалке (180–190 об /мин) в течение 5 сут. при 25оС.

Смешанный (2'-5')/(3'-5')-полиаденилат (далее смешанный полиаденилат) получали полимеризацией 2′(3′)-АМФ [5].

Активность изучаемого комплекса ферментов определяли по скорости накопления аденозина. Для этого смесь (0,5 мл), содержащую 5 мг/мл смешанного полиаденилата в 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 6,0), 10 мМ MgCl2 и 250 мкл фильтрата КЖ S. violacea, инкубировали 2 ч при 60оС. В процессе реакции аликвоты смеси подвергали тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol-UV254 (Serva, Германия) в системе растворителей изопропанол – 25%-ный аммиак – вода (7:1:2). За единицу активности ферментативного комплекса принимали такое его количество, которое обеспечивало образование 1 нмоль продукта за 1 ч реакции.

 

Результаты и обсуждение. При изучении влияния источников углерода на способность гриба S. violacea продуцировать комплекс (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза нами были исследованы гексозы, дисахариды, крахмал и многоатомные спирты. Результаты экспериментов по подбору источников углерода представлены в табл. 1.

Таблица 1

Влияние источников углерода на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом S. violacea

Источник углерода, 2%

Биомасса,

мг/мл

Ферментативная активность комплекса, ед/мл

Глицерин

8,5

845

Глюкоза

9,2

1010

Крахмал

9,4

730

Лактоза

3,6

250

Сахароза

8,9

935

Сорбит

5,4

240

Фруктоза

8,6

869

Мальтоза

10,2

845

Арабиноза

6,4

670

Ксилоза

2,1

206

 

Как видно из данных, представленных в табл. 1, гриб хорошо рос на всех изученных источниках углерода, за исключением лактозы и ксилозы, но максимальная биосинтетическая активность – 1010 ед/мл наблюдалась при росте на среде с глюкозой. Изучение влияния концентрации глюкозы на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза показало, что оптимальной является 5% концентрация этого углевода.

Из литературы известно, что добавление к синтетическим питательным средам органических источников азота стимулирует синтез микроорганизмами фосфогидролаз [6]. Результаты опытов по исследованию влияния таких добавок на продуцирование ферментного комплекса приведены в табл. 2.

Как видно из данных, представленных в табл. 2, хуже всего гриб растет на среде с добавкой дрожжевого экстракта, а лучше всего на среде с пептоном, где также наблюдается и максимальный уровень ферментативной активности.

 

Таблица 2

Влияние органических источников азота на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом S. violacea

Источник азота,

0,1%

Биомасса, мг/мл

Ферментативная активность комплекса, ед/мл

Гидролизат казеина

8,4

1240

Дрожжевой экстракт

5,0

635

Пептон

10,7

1 360

Кукурузный экстракт

8,6

1 090

 

Эксперименты по определению оптимальной концентрации пептона в среде культивирования показали, что наиболее высокий выход ферментативной активности наблюдался при 0,5%-ной концентрации этого источника азота.

Поскольку ортофосфат, являясь одним из конечных продуктов ферментативного расщепления полинуклеотидов, он способен репрессировать биосинтез ферментов, участвующих в этом расщеплении. Как следует из результатов наших экспериментов, представленных в табл. 3, увеличение концентрации фосфата в среде свыше 0,015% приводит лишь к незначительному увеличению роста культуры, но резко снижает уровень ферментативной активности филь-трата КЖ.

Таблица 3

Влияние концентрации фосфата на продуцирование комплекса

(3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом S. violacea

Концентрация

фосфата, %

Биомасса,

мг/мл

Ферментативная активность комплекса, ед/мл

0,010

14,0

2 750

0,015

14,2

2 940

0,030

14,5

1 500

0,060

15,1

560

 

Для изучения влияния аэрации среды на рост культуры и продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза гриб выращивали в колбах с различной степенью заполнения средой. Как видно из табл. 4, наиболее активно ферментный комплекс накапливается в КЖ при величине отношения объема питательной среды к объему колбы, равной 0,3–0,4. Как увеличение, так и уменьшение этого параметра приводит к снижению уровня активности ферментного комплекса. Следует отметить, что неблагоприятное влияние избыточной аэрации на биосинтез фосфогидролаз отмечали и другие авторы [6].

Таблица 4

Влияние аэрации на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом S. violacea

Степень заполнения колбы питательной средой, %

Биомасса,

мг/мл

Ферментативная активность комплекса, ед/мл

60

9,9

1 310

50

13,0

2 480

40

14,2

2 930

30

14,4

2 800

20

14,7

2 370

10

15,3

1 930

 

Результаты экспериментов по влиянию рН питательной среды на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом S. violacea суммированы в табл. 5. Видно, что гриб растет в достаточно широких пределах рН, но максимальное накопление ферментативной активности достигается при культивировании в среде с узким диапазоном рН, равном 4,5–5,0. Увеличение начального рН выше этих значений ведет к значительному снижению активности, не оказывая заметного влияния на выход биомассы продуцента.

 

 

Таблица 5

Влияние начального рН питательной среды на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом S. violacea

Начальный рН питательной среды

Биомасса,

мг/мл

Ферментативная активность комплекса, ед/мл

4,5

14,1

2 910

5,0

14,2

3 110

5,5

14,5

2 230

6,0

14,8

1 850

 

Таким образом, в результате проведенных исследований оптимизированы состав питательной среды и условия культивирования гриба S. violacea БМ-105Д – продуцента комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза, что позволило повысить выход комплекса ферментов в 3 раза по сравнению с исходным уровнем. Полученные результаты открывают перспективу создания в будущем новых препаратов для защиты растений от вирусных заболеваний.

 

Литература:

1. Devash, Y. Maltiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf disks is inhibited by (2′-5′)oligoadenylate / Y. Devash, S. Biggs, I. Sela // Science. – 1982. – Vol. 216, № 4553. – P. 1415–1416.

2. Кaнавалава, Г.I. Выкарыстанне iнгiбiтарау вiрусау пры аздарауленнi бульбы метадам культуры тканкi / Г.I. Кaнавалава // Весцi АН Беларусi, cер. бiял. навук. – 1990, № 6. – С. 70–72.

3. Kara, J. Изучение антивирусного и антиклеточного действия синтетического (2′-5′)-олигоаденилата (A2′p5′A2′p5′A) на мышах с лейкемией Раушера / J. Kara, O. Mach, J. Smrt // Acta Virol. – 1983. – Vol. 27, № 6. – P. 477–483.

4. Химико-энзиматический синтез 2′,5′-олигоаденилатов с использованием нуклеазы мицелиального гриба Spicaria violacea / Т.И. Кулак [и др.] // Химия природных соединений. – 2007. – № 2. – С. 200–201.

5. Применение нуклеаз для синтеза 2′-5′-олигоаденилатов и их аналогов / М.Я. Карпейский [и др.] // Биоорган. химия. – 1983. – Т. 9, № 4. – С. 496–504.

6. Кислые фосфатазы грибов / Л.В. Югова [и др.] // Микробиологическое производство (обзорн. информ.), М., ВНИИСЭНТИ СССР, 1991. – Вып. 8. – 18 с.