К.б.н. Титович О.И., д.б.н. Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, г. Минск

Ферментативный синтез цитидин-5'-дифосфатхолина

 

Цитидин-5'-дифосфатхолин (ЦДФХ) – коньюгат нуклеотида с холином, необходимый для биосинтеза фосфолипидов, составляющих клеточные мембраны [1]. Изучение метаболизма ЦДФХ привело к открытию его значительного фармакологического потенциала [2–4]. Установлено, что экзогенный ЦДФХ может являться эффективным лекарственным средством для терапии сосудистой недостаточности и неврологических заболеваний (в частности инсульта), травм головного мозга и болезни Паркинсона [3, 5]. Показано, что применение ЦДФХ эффективно при лечении глаукомы [6].

В настоящее время известно, что ЦДФХ образуется из цитидин-5′-трифосфата (ЦТФ) и холинфосфата в результате обратимой реакции, катализируемой холинфосфат-цитидилтрансферазой (КФ 2.7.7.15), которая широко распространена среди про- и эукариот [7].

Целью настоящего исследования является разработка метода получения ЦДФХ с помощью клеток пекарских дрожжей.

Материалы и методы. В работе использовали цитидин-5′-монофосфат (ЦМФ), ЦТФ, а также ЦДФХ, холин-хлорид и фосфохолин-хлорид фирмы «Sigma» (США). Цитидин-5′-дифосфат (ЦДФ) синтезировали, как описано нами ранее в работе [8]. Ход всех реакций контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах Silufol-UV254 фирмы Serva (Германия) в системе растворителей: диоксан–вода–25%-ный водный аммиак (6:6:1).

Для количественного определения выхода реакции пятна, содержащие ЦДФХ, элюировали 5 мл 0,05 М К-фосфатного буфера (КФБ) (рН 7,0) и замеряли оптическую плотность элюата на спектрофотометре СФ-46 («Ломо», Россия) при 271 нм. Выход ЦДФХ рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции 9,1∙103 М-1∙см-1.

Клетки коммерческих пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) высушивали при 28°С в течение 24 ч либо получали т.н. «ацетоновый порошок» путем обработки их 2 объемами ацетона.

Реакцию синтеза ЦДФХ проводили при 30°С в среде, содержащей 20 мМ ЦМФ, ЦДФ или ЦТФ, 50 мМ холин-хлорид или фосфохолин-хлорид, 0–2 мМ АТФ, 2–15%-ную глюкозу, 0,2 М КФБ (рН 7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% (по сухой массе) клетки дрожжей.

 

Результаты и их обсуждение. Выбор объекта исследований был обусловлен следующими обстоятельствами. Как мы ранее показали [9], клетки пекарских дрожжей способны трансформировать природные и модифицированные нуклеозид-5′-монофосфаты (в том числе и ЦМФ) в нуклеозид-5′-трифосфаты в условиях протекания в клетках процессов гликолиза. Также известно, что пекарские дрожжи содержат ферментные системы, необходимые для синтеза ЦДФХ [10].

Ранее в ряде работ, в том числе и нами [8], было установлено, что интактные клетки дрожжей не проявляют киназной активности при биокаталитическом фосфорилировании нуклеозидов и нуклеотидов и приобретают такую способность после перфорации клеточной стенки. В связи с этим, на первом этапе разработки метода получения ЦДФХ нами было изучено влияние способа обработки клеток пекарских дрожжей на выход целевого продукта (табл. 1).

Таблица 1

Влияние способа обработки клеток дрожжей на выход ЦДФХ

Ферментный препарат

Выход ЦДФХ, %

Время реакции, ч

Интактные клетки

0

5

Клетки, высушенные при 28°С

40–45

3–4

«Ацетоновый порошок»

20–25

4,5–5

Примечание. Состав реакционной смеси: 20 мМ ЦТФ, 50 мМ фосфохолин-хлорид, 2%-ная глюкоза, 0,2 М КФБ (рН 7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% клетки дрожжей.

 

Из табл. 1 видно, что способ обработки клеток пекарских дрожжей довольно существенно влияет на выход ЦДФХ. Однако даже в случае использования сухих клеток выход продукта не превышает 40–45%.

Далее было исследовано влияние различных исходных субстратов (ЦМФ, ЦДФ, ЦТФ) и доноров холина (холин-хлорид, фосфохолин-хлорид) на выход реакции синтеза ЦДФХ ферментами сухих пекарских дрожжей (табл. 2).

Таблица 2

Влияние различных нуклеотидных и холинсодержащих субстратов

на выход ЦДФХ

Исходный

субстрат*

Выход ЦДФХ, %

Исходный субстрат**

Выход ЦДФХ, %

ЦМФ

42–43

Фосфохолин-хлорид

44–46

ЦДФ

41–44

Холин-хлорид

10–15

ЦТФ

44–45

Холин-хлорид + АТФ

60–65

Примечания: * – реакционная смесь содержала 20 мМ ЦМФ, ЦДФ или ЦТФ, 50 мМ фосфохолин-хлорид, 2%-ную глюкозу, 0,2 М КФБ (рН 7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% клетки дрожжей; ** – реакционная смесь содержала 20 мМ ЦМФ, 50 мМ холин-хлорид или фосфохолин-хлорид, 2%-ную глюкозу, 0,2 М КФБ (рН 7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% клетки дрожжей.

 

Из табл. 2 видно, что присутствие в реакционной среде ЦМФ, ЦДФ или ЦТФ практически не влияет на выход реакции синтеза ЦДФХ, поскольку в условия гликолитического расщепления глюкозы ферменты дрожжей способны быстро трансформировать ЦМФ и ЦДФ в необходимый ЦТФ. Однако следует отметить, что с экономической точки зрения целесообразно использовать именно ЦМФ как наиболее дешевый субстрат из исследованных нуклеотидов.

Из табл. 2 также видно, что в случае присутствия в среде фосфохолин-хлорида выход целевого прдукта значительно выше, чем в присутствии холин-хлорида. Однако дополнительное внесение в реакционную смесь АТФ приводит к повышению выхода ЦДФХ. По-видимому, это связано с нехваткой внутриклеточного АТФ для действия содержащегося в дрожжах АТФ-зависимого фермента – холинкиназы. Отметим также, что холин-хлорид является намного более дешевым субстратом, чем фосфохолин-хлорид.

В ходе дальнейшей оптимизации условий синтеза ЦДФХ нами было изучено влияние концентрации глюкозы в реакционной смеси на выход целевого продукта (рис. 1). В результате данных исследований нам удалось добиться повышения выхода целевого продукта до 80–85%.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1. Влияние концентрации глюкозы на выход ЦДФХ

Состав реакционной среды: 20 мМ ЦМФ, 50 мМ холин-хлорид, 2 мМ АТФ, 2−15%-ная глюкоза, 0,2 М КФБ (рН 7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% клетки дрожжей. Длительность инкубации 3 ч.

 

Таким образом, в результате оптимизации условий синтеза ЦДФХ выход целевого продукта увеличился с 40–45% до 80–85%. Разработанный метод предусматривает использование в качестве биокатализатора сухих пекарских дрожжей, ферментные системы которых способны в результате нескольких последовательных реакций трансформировать смесь ЦМФ и холина в ЦДФХ.

Следует отметить, что ранее были описаны методы получения ЦДФХ с использованием сухих пекарских дрожжей [11, 12], однако трансформация исходных веществ (оротовая кислота, ЦМФ) в ЦДФХ в указанных работах не превышала 40–60%.

Таким образом, предложенный нами ферментативный метод синтеза ЦДФХ не уступает лучшим методам, описанным в литературе, и открывает перспективу создания технологии получения субстанции для лекарственных препаратов на основе этого метаболита.

 

Литература:

1.       Secades J.J. Frontera G. / Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. – 1995. – Vol. 17, Suppl. B. – P. 1–54.

2.       Spiers P.A. et al. / Arch. Neurol. – 1996. – Vol. 53, № 5. – P. 441–448.

3.       Dávalos A. et al. / Stroke. – 2002. – Vol. 33, № 12. – P. 2850–2857.

4.       Conant R., Schauss A. / Altern. Med. Rev.– 2004. – Vol. 9, № 1.– P. 17–31.

5.       Sudo K. et al. / Lancet. – 2004. – Vol. 363, № 9418. – P. 1364.

6.       Grieb P., Redjak R. / J. Neurosci. Res. – 2002. – Vol. 67, № 2. – P. 143–148.

7.       Kent C. / Biochim. Biophys. Acta. – 1997. – Vol. 1348, № 1–2. – P. 79–90.

8.       Titovich O.I. et al. // Biocatalytic Technology and Nanotechnology / Ed. G.E. Zaikov. – New York: Nova Science Publishers, Inc. – 2004. – P. 83–91.

9.       Zinchenko A.I. et al. / FEBS Lett. – 1990. – Vol. 260, № 2. – P. 254–256.

10.  Friesen J.A. et al. / Protein Expr. Purif. – 2001. – Vol. 21, № 1. – P. 141–148.

11.  Пат. 6387667 США / A. Maruyama, T. Fujio, S. Teshiba (Jp.); заявитель Kyowa Hakko Kogyo, Co., Ltd., Tokyo (JP) – № 08/014012; заявл. 28.01.1993; опубл. 14.05.2002.

12.  Kimura A. et al. / J. Bacteriol. – 1976. – Vol. 125, № 2. – P. 744–746.