Бурко Д.В., к.б.н. Квач С.В., д.б.н. Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, г. Минск

Создание генно-инженерного штамма-суперпродуцента пирофосфатазы

Фермент пирофосфатаза катализирует реакцию гидролиза пирофосфата до двух молекул ортофосфата, что представляет собой очень важный процесс в организме живых организмов, так как пирофосфат является побочным продуктом многих биохимических реакций, таких как, например, биосинтез РНК, ДНК, олигосахаридов, а также образуется в процессе присоединения аминокислот к соответствующим тРНК. При этом гидролиз пирофосфата не только влияет на выход целевых продуктов, но даже может определять направление протекания биохимических реакций [1].

В настоящей работе пирофосфатаза использовалась в качестве дополнительного фермента в реакции синтеза фармакологически важного диаденозин-5′,5′′′-Р¹,Р⁴-тетрафосфата (Ар₄А) с помощью генно-инженерной лизил-тРНК-синтетазы (LysU) [2]. Данная реакция является обратимой, и сдвиг равновесия в сторону образования конечного продукта зависит от наличия в реакционной среде пирофосфата, поэтому важным является его расщепление до ортофосфата с помощью пирофосфатазы, дополнительно вводимой в реакционную смесь.

Целью настоящего исследования было создание генно-инженерного штамма-суперпродуцента пирофосфатазы и изучение возможности применения этого фермента в реакции синтеза Ар₄А.

Материалы и методы исследования. В работе использовали бактерии Escherichia coli BL21(DE3) и E. coli DH5α из коллекции лаборатории молекулярной генетики Института генетики и цитологии НАН Беларуси.

Ген ppa, кодирующий пирофосфатазу, был выделен методом ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК штамма E. coli DH5α. Для амплификации гена ppa использовали следующую пару праймеров: «прямой» – (5¢-ATATTACATATGAGCTTACTCAACGTCCCTGCGGGTAAAG-3¢) и «обратный» – (5¢-CAGGTCGACTTATTTATTCTTTGCGCGCTCGAAGGA-GGC-3¢). В 5¢-окончания прямого праймера был встроен сайт рестрикции эндонуклеазы NdeI, а в праймер обратный – сайт узнавания рестриктазы SalI (выделены жирным шрифтом). Для проведения реакции амплификации использовали 1,25 ед. активности Go-Taq-полимеразы (Promega, США). Полученный в результате ПЦР продукт выделяли из геля с помощью набора реактивов «Wizard SV gel and PCR clean-up system» (Promega, США) согласно методике фирмы-изготовителя, обрабатывали смесью рестриктаз NdeI и SalI и полученную вставку с геном ppa лигировали в вектор pET24b+, содержащий T7-промотор (Novagen, США). В результате была получена плазмида pETppa8, несущая ген ppa. Сконструированным вектором были трансформированы клетки E. coli BL21(DE3) с получением нового штамма, обозначенного E. coli ppa8.

Клетки E. coli ppa8 выращивали на LB-среде, содержащей 50 мкг/мл канамицина, до оптической плотности 0,6 (λ = 600 нм); затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) до концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 5 ч. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 5000 × g.

Полученный в результате центрифугирования осадок клеток растворяли в 50 мМ Трис-HCl буфере, содержащем 0,2 мМ ЭДТА (рН 7,5). Для разрушения клеток их суспензию обрабатывали ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов UDM-10 (Techpan, Польша) при мощности 0,5 кВт в течение 10 мин при 4^оС. Затем лизат центрифугировали в течение 30 мин при 20000 × g. Супернатант, содержащий пирофосфатазу, подвергали нагреванию до 80^оС в отсутствии или присутствии 3 мМ хлорида магния и центрифугировали при 12000 × g в течение 15 мин. Полученный супернатант использовали в реакциях гидролиза пирофосфата.

Ферментативную активность пирофосфатазы анализировали по скорости реакции превращения пирофосфата в ортофосфат. Стандартная реакционная смесь (300 мкл) содержала 50 мМ Трис-HCl буфер (рН 7,5), 0,2 мМ ЭДТА, 3 мМ хлорид магния, 80 мкМ пирофосфат (Serva, Германия) и 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Смесь инкубировали при 25^оС в течение 10 мин. Ход реакции контролировали с помощью добавления малахитового реагента, который способен образовывать окрашенный комплекс с ортофосфатом. В отсутствии ортофосфата в реакционной смеси малахитовый реагент не изменяет свою окраску. Малахитовый реагент готовили, как описано в статье [3]. Измерение оптической плотности пробы проводили при длине волны 620 нм. За единицу активности пирофосфатазы принимали такое количество фермента, которое обеспечивало образование продукта в количестве 1 мкмоль за 1 мин в соответствующих условиях реакции.

Средние значения и доверительные интервалы определяемых параметров рассчитывали с применением t-критерия Стьюдента.

Полученную пирофосфатазу использовали в реакции синтеза Ар₄А. Стандартная реакционная смесь (1 мл) содержала 20 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7,5), 4 мМ хлорид магния, 150 мМ хлорид натрия, 160 мкМ сульфат цинка, 4,3 мМ АТР, 2,4 мМ L-лизин (Serva, Германия) и 0,5 ед. полученной пирофосфатазы. Смесь инкубировали при 37^оС при перемешивании на магнитной мешалке. Ход реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии в системе: диоксан – вода – 25% водный аммиак (6:4:1, об/об).

Белок определяли по модифицированному методу Лоури [4].

Результаты и их обсуждение

Клонирование гена рра и экспрессия генно-инженерного белка. Для получения пирофосфатазы ген, кодирующий данный белок, был клонирован под контролем промотора гена 10 бактериофага Т7 в плазмиде рЕТ24b+ по сайтам рестрикции NdeI и SalI с применением стандартных генно-инженерных методов. Полученная плазмида была названа рЕТрра8. Данной плазмидой трансформировали клетки E. coli BL21(DE3). Экспрессию гена индуцировали IPTG в концентрации 1 мМ. Продукт гена с молекулярной массой, приблизительно соответствовавшей размеру ожидаемого продукта (около 20 кДа на мономер), накапливался в количестве не менее 40% от общего белка, как свидетельствуют результаты SDS-полиакриламидного гель-электрофореза (рис. 1).

Рис 1. Электрофоретический анализ лизата клеток E. coli рра8 при индукции синтеза пирофосфатазы 1 мМ IPTG

М – положение и молекулярные массы (кДа) стандартных белков; 1 – белковый состав неиндуцированных клеток; 2 – белковый состав клеток, индуцированных IPTG

Очистка пирофосфатазы. Пирофосфатаза является одним из наиболее термостабильных ферментов [5]. Так как при нагревании до 80^оС большинство белков E. coli денатурируют и выпадают в осадок, в то время как пирофосфатаза сохраняет свою активность, эту процедуру можно использовать в качестве одного из этапов очистки этого фермента.

Для определения термостабильности пирофосфатазы проводили следующий эксперимент. Две пробы с лизатом, полученным после дезинтегрирования клеток E. coli ppa8, прогревали в течение 20 мин при 80^оС. В одну из проб вносили ионы магния до конечной концентрации 3 мМ, так как по литературным данным эти ионы могут стабилизировать пирофосфатазу [5]. Из табл. 1 видно, что нагревание лизата до 80^оС в течение 10 мин в присутствии ионов магния не влияет на способность пирофосфатазы катализировать реакцию гидролиза пирофосфата. При этом можно утверждать, что специфическая активность пирофосфатазы значимо возрастает за счет денатурирования и выпадения в осадок других белков.

Таблица 1

Влияние ионов магния на термоинактивацию пирофосфатазы при 80^оС

Длительность прогрева, мин	Концентрация белка, мг/мл	Активность пирофосфатазы, ед/мг белка	Общая активность, ед/мл белка
Нагревание лизата E. coli ppa8 в отсутствии ионов магния
0	1,420	1699±314	2412±343
5	1,410	903±35	1274±49
10	1,400	768±36	1075±49
15	1,410	549±36	773±49
Нагревание лизата E. coli ppa8 в присутствии 3 мМ хлорида магния
0	1,420	1699±314	2412±343
5	0,900	2181±81	1963±74
10	0,825	2288±30	1888±26
15	0,825	1485±60	1225±49
20	0,900	1278±219	1150±198

На следующем этапе работы частично очищенная пирофосфатаза была использована в реакции синтеза Ар₄А. При внесении в стандартную реакционную смесь 0,5 ед полученного фермента выход целевого продукта достигал 95%. Такой же результат получен при использовании 0,5 ед коммерческой пирофосфатазы (Serva, Германия). В отсутствии этого дополнительного фермента Ар₄А не образовывался. Таким образом, генно-инженерная пирофосфатаза способна влиять на равновесие реакции синтеза Ар₄А в сторону образования продукта за счет побочной реакции гидролиза пирофосфата.

Заключение. Таким образом, нами сконструирован бактериальный штамм-суперпродуцент пирофосфатазы и продемонстрирована возможность применения ее в качестве дополнительного фермента в реакции синтеза Ар₄А для сдвига равновесия этой реакции в сторону образования целевого продукта.

Литература:

1. Ramos A. / FEMS Microbiol. Lett. – 2003. – Vol. 225, № 1. – Р. 85–92.

2. Квач С.В., Бурко Д.В. / Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2006. – № 5, Ч. 1. – С. 82–84.

3. Rumsfeld J. / Protein Expr. Purif. – 2000. –Vol. 18, № 3. – Р. 303–309.

4. Pеterson G.L. / Anal. Biochem. – 1997. – Vol. 83, № 2. – Р. 436–356.

5. Josse J. / J. Biol. Chem. – 1966. – Vol. 241, № 9. – P. 1938–1947.