Определение ассоциаций интронного полиморфизма гена IL1Ra с ревматическим поражением клапанов сердца.

Ю.С. Манько, А. В. Понасенко, А.С. Головкин

ФГБУ "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" СО РАМН, г. Кемерово, Россия

Изучение микросателлитных полиморфизмов в регуляторных регионах генов позволяет обнаружить локусы, ответственные за ряд патологических процессов, звеньев в патогенезе многофакторных заболеваний. Ключевое значение в формировании ревматического поражения клапанов сердца имеет выраженность иммунного воспаления в эндокарде. Неоднократными исследованиями доказано, что сила и качество иммунного ответа на антигены экзогенного и эндогенного происхождения генетически детерминированы не только по HLA, но и по генам цитокинов. С этих позиций вполне оправдан поиск кандидатных маркеров риска по полиморфным локусам генов интерлейкинов, играющих одну из ключевых ролей в иммунологическом реагировании Очевидно, что индивидуальный набор аллельных вариантов генов цитокинов может определять интенсивность развития, регуляцию и исход воспалительного процесса. При этом, интерлейкин 1(IL-1) является цитокином острой фазы воспалительного ответа и имеет широкий диапазон биологических и физиологических эффектов, а основным блокатором его мембранных рецепторов является рецепторный антагонист интерлейкина 1 (IL-1Ra). За счёт конкурентной связи со специфическими рецепторами, IL-1Ra нивелирует эффекты IL-1. IL-1Ra считается важным регулятором иммунного реагирования и несколько исследований показали, что полиморфизм числа тандемных повторов (VNTR) во втором интроне гена IL-1Ra играет определяющее значение в вариабельности иммунного ответа.

Цель: Оценить возможность использования локуса второго интрона (микросателитный полиморфизм, 86 п.о) гена IL1Ra (IL-1Ra (VNTR-intr2) в качестве кандидатного, при определения риска формирования ревматического поражения клапанного аппарата сердца.

Материалы и методы: В группу исследования включены 74 пациента, прооперированных на базе ФГБУ «НИИ КПССЗ» СО РАМН (г.Кемерово, Россия) по поводу ревматического порока митрального клапана сердца. Популяционную группу (контроль) составили 264 донора, не имеющих ревматических заболеваний в анамнезе. Группы были сопоставимы по гендерным и возрастным характеристикам. ДНК выделяли из лимфоцитов венозной периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции с последующим осаждением в этаноле (Sambrook J.,1989). Генотипирование IL-1Ra (VNTR-intr2) проводили методом одноэтапной ПЦР с праймерами фланкирующими район второго интрона («СибДНК», НИХБФМ СО РАН, Россия). Использовали ПЦР режимы предлагаемые производителем. В ходе генотипирования определяли четыре аллеля: с двумя, тремя, четырьмя и пятью тандемными повторами соответственно. Аллели обозначались по числу тандемных повторов 2R (R- repeated), 3R, 4R, 5R (соответственно 2, 3, 4 и 5 тандемным повторам). Детекцию продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 6% полиакриламидном геле с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете в трансилюминаторе. В качестве контроля длин фрагментов использовался маркер молекулярного веса (ДНК плазмиды pBluscriptSKII, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции MspI (СибЭнзим, Россия)). Для статистического анализа использовали программное обеспечение Statistica 6.0. При анализе результатов генотипирования учитывали соблюдение равновесия Харди-Вайнберга (тест χ2). Для попарного сравнения частот генотипов и аллелей между анализируемыми группами использовали критерий χ2 Пирсона с поправкой Йейтса на непрерывность. Различия считали статистически значимыми при p < 0,001.

Результаты: В результате генетического тестирования было определено, что в обеих группах встречалось носительство всех определяемых аллелей (2R, 3R, 4R, 5R). Однако, анализ частоты встречаемости аллельных вариантов в двух анализируемых группах показал, что в группе контроля аллель 2R встречалась значимо чаще (36,2% против 14,2%, p<0,001), а аллель 3R встречалась значимо реже (2,6 % против 15,6%, p<0,001). При этом, в обеих группах доминирующей являлась аллель 4R (56,3 % в контрольной и 68, 9% в группе исследования). Анализ частоты встречаемости генотипов определил, что в контрольной группе преобладает носительство гетерозиготного генотипа 2R/4R (58,7%), а в группе исследования гомозиготного 4R/4R (52,7%). Соответственно, генотип 2R/4R имел отрицательную корреляцию с риском формирования порока митрального клапана ревматической этиологии (ОР=0,01, 95% ДИ 0,03-0,37; p<0,001), а генотип 4R/4R – положительную корреляцию (ОР=3,63, 95% ДИ 1,08-11,57; p<0,001). Положительная корреляция была обнаружена и для генотипа 3R/4R. Генотип 3R/4R значимо чаще встречался в группе исследования по отношению к группе контроля (20,3% против 1,9%), и был связан с высоким относительным риском формирования порока (ОР=12,29, 95% ДИ 6,59-22,88; p<0,001). В обеих группах генотипы 2R/3R, 3R/3R, 3R/5R, встречались редко. Частота встречаемости данных генотипов не превышала 2% как в группе исследования, так и в группе контроля. При этом, частота генотипа 2R/5R в группе контроля составила 5,7%, а в группе исследования он не встречался. В противоположность, генотип 5R/5R имел распространённость в 1,4 % в группе исследования, и не определялся в группе контроля.

Заключение: Микросателитный полиморфизм второго интрона гена IL1Ra может быть маркером риска формирования иммуноопосредованных пороков сердца при ревматической болезни сердца. Так, носительство аллелей с общим числом тандемных повторов более трёх и генотипов, с их составляющих увеличивает риск формирования порока. Носительство генотипа 3R/4R увеличивает относительный риск в 12 раз (ОР=12,29, 95% ДИ 6,59-22,88).