Биологические науки, 6

Кохан В. С., Соколова І. Є.

Дніпропетровський національний університет

Дослідження ролі мРНК в перенесенні генетичної

інформації

Відомо, що горизонтальне перенесення генів (у вигляді плазмідної ДНК та нуклеоїдних уламків) відіграє неабияку роль в еволюції прокаріот. На практиці, в першу чергу, важливо набуття бактеріями антибіотикостійкості, а також генів патогенності. Відомі різновиди таких рекомбінацій не можуть пояснити всю різноманітність горизонтального переносу генів як серед представників царства бактерій, так і між організмами різних таксонів. мРНК в світлі цього набуває вигідних позицій як більш універсальне та мінливе знаряддя перенесення гене-тичної інформації між широким колом організмів. На це ще й вказує недавно відкрита нерепликативна негомологічна рекомбінація у РНК-вмісних поліо-вірусів, яка, по припущенню дослідників, може відбуватись автокаталітично [1].

Метою цієї роботи було встановити здатність мРНК до перенесення генетичної інформації від представника однієї родини бактерій до представника іншої. Дослідними об'єктами були: Staphilococcus aureus - донор, 2 штами Ec-herichia coli (природний - від здорової людини та чиста лінія Е. coli XL Gold) - реципієнти. Селективним маркером для підтвердження переносу генів був обраний синтез плазмокоагулази. Як носій генетичної інформації використовували сумарну мРНК S. aureus з переважним вмістом мРНК плазмокоагулази, індукований культиву-ванням S. aureus у плазмі крові.

S. aureus підрощували на середовищі МПА, потім пересівали на LB-середовище стандартного складу з додаванням 0,01 М треоніну та інкубували при 37°С 16 год. Для індукції транскрипції і накопичення мРНК плазмокоагула-зи після центрифугування штам ресуспендували у плазмі крові людини, інкубували 20 хв при 37°С. Потім проводили деструкцію клітин та вилучення нуклеїнових кислот за стандартною методикою [2]. Руйнування ДНК проводили ДНК-азою у буфері ТРИС-ЕДТА з 0,002 М MgCL₂ упродовж 30 хв при 37°С та переосаджували 2 об'ємами етилового спирту з додаванням 0,1 об'єму 3 М натрію ацетату (рН 6).

Ми вважаємо, що привнесення генетичної інформації до геному за допомо-гою мРНК може відбуватися за участю зворотної транскриптази, яка з великою вірогідністю може знаходитись у геномі природної Е. соli, виділеної у людини, яка мала контакт з РНК-вмісними вірусами. Виходячи з того, що може бути декілька механізмів рекомбінації РНК, нами було використано 2 штами Е. coli: 1) чиста лінія Е. coli XL Gold; 2) природний штам Е. coli. Чиста лінія Е. coli XL Gold не має гену зворотної транскриптази, тому можливе виявлення у майбутньому плазмокоагулазної активністі мало бути результатом дії іншого механізму рекомбінації. До трансформації штами Е. coli було перевірено і встановлено, що вони не коагулюють нерозведену плазму крові та не розмножуються в ній.

Е. coli XL Gold вирощували на МПА з додаванням 0.5 мкг/мл тетрацикліну (має хромосомний ген стійкості до цього антибіотика). Природний штам Е. coli вирощували на середовищі Плоскірєва з лактозою та індикатором. Для отри-мання компетентних клітин штами підрощували в середовищі SOB з додаванням 20 мМ MgCL₂ упродовж 16 год.

Трансформацію Е. coli проводили сумарною фракцією мРНК S. aureus за мо-дифікованою методикою трансформації, яка відрізняється від стандартної відсутністю стадії з додаванням дитіотрейтолу [3].

Відбір трансформантів Е. coli проводили на середовищі МПА з додаванням людської плазми (15% за об'ємом, підібрано експериментально) - індикатора синтезу плазмокоагулази та тетрацикліном (0.5 мкг/мл, тільки для Е. coli XL Gold). При синтезі реципієнтами плазмокоагулази спостерігали помутніння навкруги колоній, пов'язане з проявом плазмокоагулазної активності.

Після інкубування трансформантів при 37°С 16 год на МПА були відібрані коагулазо-позитивні колонії обох штамів Е. coli та пересіяні у 2 мл не-розведеної людської плазми (до кінцевої концентрації 10⁷ кл/мл ). Через 12 год для Е. coli XL Gold та через 3 год для природного штаму Е. coli спостерігали коагуляцію плазми. Інтенсивно розмножувався в ній тільки природній штам Е. coli.

Для визначення концентрації клітин трансформантів у плазмі крові висівали 0,05 мл розведеної культури (0,02 мл плазми змішували з 1,98 мл Н₂О) на МПА, інкубували 16 год при 37°С та підраховували колонії.

Таблиця 1. Активність трансформантів E. coli в плазмі крові

Назва штаму	Коагуляція	А*	Розмноження	В**
S. aureus (контроль)	+	1	+	не спостерігали
E. coli (природна)	+	0,85	+	1,8
E. coli XL Gold	+	0,1	-	0,3

Пояснення до таблиці: А* – відношення об'єму фібринового коагулята досліджувоного трансформанта до того ж об'єму у контролі (S. aureus), В** – відношення життєздатних бактерій після 12 год інкубування у плазмі до їх концентрації на початку експерименту.

Як видно з таблиці 1, інтенсивність коагуляції плазми штамом Е. coli XL Gold дуже невелика (А=0,1), порівняно з такою S. aureus та трансформованої природної Е. coli (А=0,85). Також треба відзначити нездатність до розмноження трансформованої Е. соїі XL Gold (В=0,3), тоді як природна Е. coli отримала здатність до згортання плазми та й добре роз-множувалась у ній (В=1,8). Надалі, через декілька пасажів, Е. coli XL Gold втратила здатність коагулювати плазму, тоді як природний штам її зберіг. Слід відмітити, що нездатність до розмноження у плазмі Е. coli XL Gold може пояснюватись різними механізмами. По-перше, трансформація мРНК може завершуватись потраплянням її на рибосоми реципієнта, наступною трансляцією та досить швидкою деградацією, внаслідок чого через декілька ділень плазмокоагулазна активність зникає. По-друге, можна припустити наявність механізму копіювання мРНК (відмінного від зворотньотранскриптазного) з утворенням ДНК-ової копії, яка вбудовуєть-ся у хромосому та через деякий час ілімінується.

Виходячи з отриманих даних можна твердити, що мРНК може бути носієм генетичної інформації, яка не тільки зберігається у дочірніх клітинах, але й ефективно транслюється. Також ми припускаємо наявність не менше 2 механізмів цього процесу: 1) за допомогою зворотної транскриптази (коли вона є), таку можливість встановлено на прикладі трансформації природної Е. coli, 2) за допомогою іншого механізму - на прикладі Е. coli XL Gold, у якої, як відомо, зворотної транскриптази немає. Висновки про механізми взаємодії мРНК з геномом бактерій є лише нашими припущеннями і потребують додаткових досліджень, тоді як можливість передачі генетичноі інформації за допомогою мРНК була встановлена експериментально.

1. Nagai M., Sakoda Y., Mori M., Hayashi M., Kida H. and Akashi H. Insertion of cellular sequence and RNA recombination in the structural protein coding region of cytopathogenic bovine viral diarrhoea virus// J. Gen. Virol.- 2003.- vol 84.- P. 447–452.

2. Klaenhammer T.R. A general method for plasmid isolation in lactobacilli// Current Microbiol.- 1984.- P. 23-28.

3. Гловер Д. Клонування ДНК. Методи// 1988. –М.: Мир.- 538 с.