Биологические науки/6. Микробиология

Гудзенко Т.В., Волювач О.В., Бухтіяров А.Є., Лісютін Г.В., Конуп І.П., Бєляєва Т.О., Пузирьова І.В., Горшкова О.Г., Штеніков М.Д.,

Дімова М.І., Стьопина Т.О., Писарська М.М, Остапчук Т.О.

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Одеса

Дослідження нафтоокиснювальної активності, здатності продукувати біосурфактанти і антибіотикочутливості мікроорганізмів, виділених із нафтозабруднених грунтів

Дослідження нафтоокиснювальної активності, здатності продукувати біосурфактанти і антибіотикочутливості штамів грунтових мікроорганізмів, є важливими і необхідними для виготовлення на їх основі біопрепарату, призначеного для широкого використання в екобіотехнології очищення грунтів від хронічних нафтових забруднень за екстремальних умов навколишнього середовища (наявність солей, іонів важких металів) [1, 2].

Об’єктами дослідження слугували деякі штами мікроорганізмів, виділені із нафтозабрудненого грунту та ідентифіковані як штами Bacillus sp. 1₇, Bacillus sp. 2₂ і Bacillus sp. 2₄ .

Індикацію нафтоокиснювальної активності бактерій проводили за зменшенням кількості введеної нафти (10 мг нафти на 10 мл середовища) у мінеральне калієво-дріжджове середовище (МКД) з мікроорганізмами по відношенню до контролю - МКД з нафтою у відсутності мікроорганізмів. Кількісний облік біодеструкції нафти проводили методом ІЧ-спектрометрії. Аналітичні сигнали проб реєстрували аналізатором “ИКС-29” в діапазоні хвильових чисел 2700-3200 см^-1.

Здатність бактерій продукувати біосурфактанти (біологічні поверхнево-активні речовини – біо-ПАР) в залежності від часу культивування і складу поживного середовища оцінювали за появою поверхнево-активних властивостей бактеріальних суспензій, що фіксували тензіометрично за допомогою методу Вільгельми. З метою визначення типу біосурфактантів – позаклітинні або клітинно-зв’язані, бактеріальні клітини відділяли центрифугуванням (6500 обор/хв. протягом 20 хв) та вимірювали поверхневий натяг одержаних супернатантів.

Чутливість сапрофітних мікроорганізмів до 8 антибіотичних препаратів (АБП) п’яти класів з різною хімічною будовою визначали диско-дифузійним методом.

У результаті проведеного хімічного аналізу визначено, що протягом 90 діб по відношенню до контролю найбільш активно на 87,5 % проходила біодеструкція істинно-розчинних і емульгованих вуглеводнів нафти у об’ємі проб, що містили бактеріальні суспензії зі штамами Bacillus sp. 1₇ і Bacillus sp. 2₄. При цьому залишковий вміст нафтових вуглеводнів склав 0,16±0,02 мг і 0,16±0,01 мг відповідно. Дещо в меншому ступені відбувалась деструкція істинно-розчинних і емульгованих вуглеводнів нафти (на 56,3%) в бактеріальній суспензії зі штамом Bacillus sp. 2₂.

Хімічний аналіз на залишковий вміст нафтових вуглеводнів, адсорбованих на стінках пробірок і тих, що містились в плівках дозволив стверджувати, що грунтові мікроорганізми, виділені із нафтозабрудненого грунту, в лабораторних дослідах при температурі 28⁰ С утилізують сиру нафту з густиною 0,84 г/см³ більш ніж на 60 % і за своєю нафтодеструктивною здатністю розташовуються в такій послідовності: Bacillus 2₄ (83,9%) > Bacillus 1₇ (77,5%) > Bacillus 2₂ (64,9%).

Тензіометричні дослідження поверхнево-активних властивостей бактеріальних суспензій показали, що рівноважні значення поверхневого натягу культур бактерій роду Bacillus і їх супернатантів відносно дистильованої води (контроль № 1) і поживного середовища (контроль № 2) установлювались при температурі 25⁰С не менше 2-х годин. Бактерії культивували протягом п’яти діб на поживному середовищі М-9 за відсутністю пептону і дріжджового екстракту (контроль № 2), тобто на середовищі, яке використовували для виготовлення нового біопрепарату – деструктора хронічних нафтових забруднень. Для контролю № 2 за відсутністю мікроорганізмів значення поверхневого натягу складало відповідно 67,9 мДж/м² і за присутністю мікроорганізмів зменшувалось до 48,3÷52,3 мДж/м² . Експериментально підтверджено, що штами Bacillus sp. 2₄ і Bacillus sp. 2₂ продукували в основному позаклітинні біо-ПАР, а штам Bacillus sp. 1₇ – клітинно-зв’язані та позаклітинні біо-ПАР, про що свідчили поверхнево-активні властивості їх супернатантів.

Перевірка антибіотикочутливості мікроорганізмів до різних антибіотичних препаратів показала: штами Bacillus sp. 1₇ і Bacillus sp. 2₂ проявляли високу чутливість лише за дії стрептоміцину (III кл. аміноглікозиди). Штам Bacillus sp. 2₄, резистентний по відношенню до стрептоміцину, виявляв високу чутливість до тетрацикліну (IV кл. тетрацикліни), d=27±2 мм. До ампіциліну, карбеніциліну (I кл. бета-лактами, пеніциліни), поліміксину (V кл. поліпептиди) усі бактерії були резистентними. Досліджувані штами виявляли малу чутливість по відношенню і до еритроміцину, олеандоміцину (II кл. макроліди) та неоміцину (III кл. аміноглікозиди). Взагалі антибіотикорезистентність посилювалась при переході від штаму Bacillus sp. 2₂ до штаму Bacillus sp. 2₄, який із 8 АБП був стійким або малочутливим до 7 АБП.

Отже, на підставі проведених досліджень пропонуємо використовувати антибіотикорезистентні штами Bacillus sp. 1₇, Bacillus sp. 2_2, Bacillus sp. 2₄ для виготовлення на поживному середовищі М-9 (за відсутністю пептону та дріжджів) поверхнево-активного біопрепарату-деструктора хронічних нафтових забруднень.

Список використаної літератури:

1. Гудзенко Т.В. и др. Оцінка нафтоокиснювальної активності мікроорганізмів, виділених із нафтозабруднених грунтів о. Зміїний // Материалы X Международной научно-практической конф. «Ключевые проблемы современной науки –  2014». – Болгария (г. София) - С. 47-49.

2. Гудзенко Т.В. и др. Дослідження антибіотикорезистентності мікроорганізмів, здатних окиснювати нафту // Материалы X Международной научно-практической конф. «Дни науки -2014». – Чехия (Прага). - С. 44-46.