Біологічні науки/Біохімія і біофізика.

¹Асист. Яремкевич О.С., ²Доц. Целевич М.В.

¹Кафедра органічної хімії, Національний університет «Львівська політехніка», вул. С. Бандери, 12, м. Львів, 79013

²Кафедра біофізики та біоінформатики,

Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів

Морфологія зародків в’юна за умов впливу біологічно активних речовин впродовж ембріогенезу

Дослідження в області синтезу нових біологічно активних сполук з подальшим пошуком лікарських препаратів, розробка новітніх технологій їх одержання є актуальним завданням сьогодення. Такі біологічно активні речовини, як амінокислоти виконують найважливіші функції для підтримки процесів гомеостазу в організмах тварин та людини, а декотрі з них використовуються в якості антитоксичних лікарських препаратів. Це пояснюється їх здатністю брати участь в азотистому обміні, в синтезі необхідних для нормальної життєздатності організму білків, ферментів, гормонів, тощо. Синтетичні N-похідні 1,4-нафтохінону мають перспективи практичного використання в медицині та фармакології, оскільки володіють низькою токсичністю, проявляють активність в реакціях, як з пероксидними, так і з алкільними радикалами, гальмують окиснення при надлишковому й низькому тиску кисню, частково захищають ліпіди при гіпоксії й при небезпеці виникнення інфаркту. Природні хінони та їх похідні показали свою перспективність як інгібітори пероксидного окислення ліпідів при гіпоксичному стані.

Одержані на кафедрі технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології нові низькотоксичні сполуки мають високу протигіпоксичну, протиішемічну та протисудомну дію, можуть бути використані у фармацевтичній промисловості для створення нових лікарських препаратів з церебропротекторною дією. Особливу увагу слід звернути на калієву сіль β-N-(2-хлор-1,4-нафтохіноніл-3)-аланіну, яка виявляла найбільш виразну захисну дію на щурах в умовах гіпоксичного та ішемічного станів [1]. Тому детальне дослідження впливу похідних нафтохінону та амінокислот на зародкові клітини прісноводної риби в’юна Misqurnus fosslis L. в період раннього ембріогенезу є актуальним та перспективним, і дасть можливість поглибленого розуміння механізмів біологічного дії цих речовин, покращення їх лікувальних властивостей, що матиме вагоме значення для фармакології і медицини.

Оскільки зародки в’юна в період раннього ембріогенезу є адекватною тест-системою для дослідження впливу різних фармакологічних та хімічних чинників на живі організми [2-4], тому мета роботи полягала у з’ясуванні впливу амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону (калієвих солей 2-амінокислот-3-хлор-1,4-нафтохінону) таких як аланін, аспарагін, глютамін, гістидин та тирозин (у концентрації 0,071 мкг/мл) на морфологію зародків в’юна упродовж ембріогенезу. Проведена оцінка впливу вищесказаних речовин протягом передличинкової стадії – періоду синхронних поділів бластомерів, утворення морули, бластули, гаструли – до періоду утворення перших 10 пар тулубових сомітів (27 година розвитку). Контрольні зародки інкубували в розчині Гольтфретера для холоднокровних.

У зародків, які розвивалися у досліджуваних розчинах з концентрацією 0,071 мкг/мл, спостерігалося відділення жовткової оболонки від поверхні бластомера, утворення перивіталінового простору і формування цитоплазматичного горбика, як це спостерігали у контрольних дослідах. Перший поділ відбувався через 60 хв (2 бластомери) і кожний наступний – через 30±2 хв, і відповідав визначеним стадіям за таблицями нормального розвитку Астаурова [5]. Наступні стадії утворення бластомерів ще відповідали часовим нормам – 2,5 години розвитку – чітко прослідковується утворення 16 бластомерів (4 поділ), хоч деяка незначна частина зародків припиняла свій розвиток, який проявлявся у відсутністі або нерівномірниму утворенні бластомерів. Наприклад, присутність в середовищі 0,071 мкг/мл калієвої солі гістидину вела до значної деформації зародкових клітин та часткового руйнування жовтка, що унеможливлювало подальший розвиток. Тоді як додавання до середовища інкубації калієвої солі аланіну у тій самій концентрації вело до затримки поділів бластомерів – приблизно на годину (2τ_о) – замість 16 бластомерів виявлено 4 бластомери.

Подібні зміни у розвитку зародків спостерігали і за присутності в середовищі інкубації амінокислотних похідних аспарагіну, тирозину та глутаміну. При подальшій інкубації зародків в середовищі з додаванням досліджуваних розчинів амінокислот тенденція до затримки розвитку не тільки зберігалася, але й зростала. За таких умов інкубації виявлено сповільнення розвитку на 4τ_о (2 години). Так, при дії калієвих солей аспарагіну та глутаміну на четвертій годині розвитку виявлено утворення тільки 16 бластомерів, замість необхідних 128 зародкових клітин. У деяких випадах відбулося лише утворення цитоплазматичного горбика, однак не виявлено першого поділу бластомерів.

Утворення згущення цитоплазми та аномальних клітин виявлено за умов впливу калієвої солі глутаміну. Однак, тільки у незначної кількості зародків (менше 5%) виявлено нормальне формування зародкових клітин.

Найбільш «агресивну» дію по відношенню до розвитку зародків виявили для калієвої солі 2-тирозину-3-хлор-1,4-нафтохінону. На четвертій годині інкубації в середовищі за наявності вищезаначеної амінокислотної похідної спостерігали чітке сповільнення розвитку зародків ще на стадії 2 бластомерів. За дії калієвої солі тирозину також виявлено аномальне згущення цитоплазми, що в подальшому призводило до некрозу.

Отже, в результаті проведених досліджень встановлено, що вплив усіх амінокислотних похідних нафтохінону концентрацією 0,071 мкг/мл через 3,5-4 години розвитку привзодить до затримки поділів бластомерів, які в свою чергу були деформованими та втрачали міжклітинні контакти із сусідніми бластомерами. Подальше інкубування зародків за присутності досліджуваних речовин концентрацією 0,071 мкг/мл (7,1×10^-2 мкг/мл) спричинило їх загибель на стадії формування сомітів тулуба – через 27 годин після запліднення.

Тільки у незначної кількості зародків, які вижили, спостерігався нормальний розвиток – відбувалася закладка центральної нервової системи, завершився процес обростання жовтка бластодермою, зародки були витягнуті у довжину, передній кінець якого розширений, а задній дещо піднятий над жовтковою пробкою. Зародки, які пройшли ці етапи розвитку виявлено за умов впливу усіх досліджуваних амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону.

На підставі отриманих результатів можна зробити висновок, що вищевказані речовини в концентрації 0,071 мкг/мл проявлять ембріотоксичні властивості й зумовлюють сповільнення та аномалії розвитку, оскільки з’являються деформовані бластомери, котрі втрачають контакти з сусідніми зародковими клітинами, особливо „агресивну” дію серед досліджуваних амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону проявляла калієва сіль 2-тирозин-3-хлор-1,4-нафтохінону. Тому, для проведення подальших біофізичних та біохімічних досліджень доцільно використовувати розчини амінокислитних похідних 1,4-нафтохінону у концентрації 7,1×10^-6 мкг/мл, оскільки дані речовини здатні легко проникати через перивітелінову оболонку та плазматичну мембрану бластомерів.

Література

1. Миколів О.Б., Журахівська Л.Р., Комаровська-Порохнявець О.З., Марінцова Н.Г., Новіков В.П. Застосування калієвої солі N-(1,4-діоксо-3-хлор-1,4-дигідронат-2-ил) аланіну як сполуки, що проявляє протисудомну дію. Пат.України №19337 15.12.2006, Бюл. №12, 2006 р.

2. Целевич М.В., Кулачковський О.Р., Косарчин С.В., Санагурський Д.І. Ультраструктура бластомерів зародків в’юна за умов впливу антибіотика бороцину // Acta Medica Leopoliensia . – 2005. – Т. 11, №3. – С. 161-165.

3. Бойко Н., Целевич М., Санагурський Д.І. Вплив йонів важких металів на активність Na⁺, K⁺–АТФази та динаміку трансмембранного потенціалу зародків в'юна // Вісник Львів. ун-ту, Сер. Біол. 2002. Вип. 29. С. 25-31.

4. Перун М.В., Іленкова О.С., Целевич М.В. та інші. Na⁺, К⁺-АТРазна активність зародків в’юна in vitro за умов впливу поверхнево активного полімеру // Матеріали ІІІ міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ біології”. Львів, 2007. С. 21-22.

5. Объекты биологии развития// Под.ред. Астаурова Б.А. – М.: Наука, 1975. – 579с.