К.б.н., И.С. Сесорова

Ивановская государственная медицинская академия, Россия

Анализ ультраструктурных изменений комплекса Гольджи в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, индуцированных действием N-этилмалеимида

Род дрожжей Saccharomyces cerevisiae широко используется в качестве модельной системы, в том числе, для изучении внутриклеточного транспорта. Однако единого мнения по вопросам механизмов секреции в клетках дрожжей на сегодняшний день нет, прежде всего, по причинам существования спорных вопросов ультраструктурной организации органеллы. Долгое время транспорт у дрожжей описывался «везикулярной» моделью. Этому способствовало мнение о морфологическом строении органеллы не отличающемся по строению от КГ клеток высших эукариот. Везикулам в структуре КГ клеток грибов приписывается возможность как антеградного, так и ретроградного транспорта [3]. Чаще всего с ретроградным транспортом связывают COPI производные везикулы [6]. С открытием в мицелярных грибах и в некоторых дрожжах структуры КГ не формирующей стопку для описания механизмов транспорта через органеллу была предложена модель «созревания и прогрессии» цистерн, существенно, при этом, адаптированная к каждой клеточной системе [5]. В модели предполагается, как считают авторы, отсутствие классического прогрессивного преобразования одной цистерны в другую. Тем не менее, наблюдается трансформация элементов секреторного пути: сети ЭР в трубчатую сеть, а последней в узелковую сеть с формированием, в конечном итоге, секреторных гранул. При этом не многочисленным СОРI везикулам отводиться ролью ретроградных транспортных переносчиков ферментов, SNARE – белков и других резидентных молекул КГ, что способствует созреванию следующего по ходу элемента секреторного пути. Однако, выявленные в последние годы особенности ультраструктуры мицелярных грибов, а так же дрожжей, в том числе в клетках дикого типа Saccharomyces cerevisiae, плохо согласуются с ведущими моделями секреторного транспорта [4, 5]. Поэтому существует необходимость уточнения морфологического строения секреторных путей в клетках грибов, не имеющих стопочной структуры КГ с известными молекулярными механизмами транспорта белков через АГ и предлагаемыми моделями. Поэтому мы поставили целью доказать наличие СОРI и активность СОРI производных везикул в структуре КГ дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Материалы и методы исследования. Клетки дрожжей штамма RSY 248 (MAT SEC + his 4-619 выращивались в жидкой среде YPD, содержащей 2% бактериального пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы. В экспериментальный образец добавлялся 100 mM раствор N-ethylmaleimide (NEM) SIGMA (USA), и клетки инкубировались в течении 15 минут на льду. Затем образцы вновь отмывали, фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом и готовили для ЭМ эпоновых срезов.

Результаты и их обсуждение. Доказательством степени активности покрытия и выраженности везикулярного компонента в КГ клеток дрожжей стало экспериментальное воздействие на систему слияния везикул. Известно, что цитоплазматическое слияние мембран и их производных в клетке контролируется особым классом белков - SNARЕ, которые концентрируются на месте бедующего слияния мембран, не только приближая их, но и удерживая более длительное, чем случайное соударение, время, способствуя их слиянию, даже при обычных концентрациях ионов кальция [2]. При этом, точность адресного слияния мембран секреторного пути будет определяться специфичностью комбинации SNARЕ-белков на донорской и акцепторной мембранах (Hong et al., 2005), после взаимодействия которых на последней сформируется SNARЕ комплекс из четырех белков [1]. Подготовка к следующему циклу слияния происходит с помощью белка SNAP и малой АТФазы- катализирующей структурные изменения в образовавшемся комплексе. Поэтому при инактивации одного из данных белков работа SNARЕ механизма будет нарушена и слияние мембран прекратится. NSF имеет высокую чувствительность к NEM, блокирующему белок по S-H - группам. Поэтому при обработке клеток NEM, имеющей функционально активный СОРI, образование везикул сохранится, а их адресное слияние прекращается. Пузырьки отщепляются от мешочков КГ и накапливаться в «зоне» органеллы. При этом регистрируется уменьшение объема мембран мешочков и накопление в зоне КГ свободных пузырьков. Проведенные исследования показали отсутствие мембранной трансформации КГ при обработке NEM клеток Saccharomyces cerevisiae, что указывает либо на их отсутствие, либо на крайне не значительное количество.

Таким образом, проведенный эксперимент показывает несостоятельность транспортных моделей в клетках дрожжей, основанных на свободных везикулах, как транспортных переносчиков молекул через комплекс Гольджи.

Литература:

1. Farquhar M., Palade G. 1998. The Golgi apparatus: 100 years of progress and controversy// Trends. Cell Biol. V. 8. P. 2—10.

2. Hong W. SNAREs and traffic// Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1744. P. 493-517.

3. Lee M.C.S., Miller E.A., Goldberg J., Orci L. and Schekman R. Bi-directional protein transport between the ER and Golgi// Annu. Rev. Cell. Devel. Biol. 2004. V. 20. P. 87-123.

4. Preuss D., J. Mulholland A. Franzusoff N. Segev and D. Botstein. Characterization of the Saccharomyces Golgi complex through the cell cycle by immunoelectron microscopy// Mol. Biol. Cell. 1992. V. 3. P. 789-803.

5. Rambourg A., Jackson C., Clermont Y. Three dimensional configuration of the secretory pathway and segregation of secretion granules in the yeast Saccharomyces cerevisiae// J. Cell. Science. 2001. V. 114. P. 2231–2239.

6. Rothman J. E., and F. T. Wieland. Protein sorting by transport vesicles//Science. 1996. V. 272. P. 227-234.115.