Жуков В.І., *Перепадя С.В., Моісеєнко А.С., Кнігавко В.Г., Зайцева О.В., Мірошниченко Н.М., Рисована Л.М.

Харківський національний медичний університет, м. Харків, Україна

* Харківська академія післядипломної освіти, м. Харків, Україна

Динаміка активності дезамінування у хворих колоректальним раком при хронічній обтураційній товстокишковій непрохідності і його прогностичне значення

Для вирішення фундаментальних проблем патогенезу захворювань першочергове значення має вивчення природи ключових ферментів, порушення функцій яких часто представляє собою провідний ланцюг у механізмах дисфункції процесів обміну речовин при патологічних станах. За останні роки накопичено достатньо даних, які свідчать про важливе патогенетичне значення порушень каталітичної функції моноамінооксидази (МАО) при багатьох захворюваннях центральної нервової системи, серцево-судинної системи, психічних і онкологічних патологіях [1]. МАО каталізують окислювальне дезамінування первинних, вторинних і третинних моноамінів з утворенням альдегідів і, таким чином, підтримують на визначеному фізіологічному рівні вміст катехоламінів, серотоніну і гістаміну. Сьогодні загальноприйнятим є існування двох основних типів МАО-А і В. Активність МАО типу А блокують вельми низькі концентрації хлоргілину і специфічними субстратами є норадреналін і серотонін. Активність МАО-В гальмує лише значно більш високі концентрації хлоргілину; вибірковим інгібітором цього типу є депреніл, а специфічними субстратами бензиламін, β-фенілетиламін і β-метилгістамін. Багато важливих амінів (наприклад, тирамін, дофамін) дезамінуються МАО обома типами А і В. Дослідження багатьох авторів підтверджують гіпотезу про існування множинних форм МАО [2-4].

Як відомо, колоректальний рак (КРР) розвивається на тлі порушення гомеостатичної функції організму. Велике значення в цьому процесі належить зниженню активності симпато-адреналової системи і продукції біогенних моноамінів – катехоламінів. Виснаження їх запасів характеризує стан хронічного стресу, який супроводжується пригніченням ерготропної функції та підсиленням швидкості старіння організму. Забезпечуючи інактивацію амінів, МАО приймає участь у захисті організму від токсичних екзогенних або ендогенних амінів, у регуляції рівнів медіаторів і самих медіаторних процесів. Подібність процесів обміну біогенних амінів у різних тканинах дає змогу для використання тромбоцитів у якості моделі визначення динаміки МАО у хворих.

Виходячи із усього вище сказаного, дослідження активності МАО в тромбоцитах крові, біогенних моноамінів – серотоніну, дофаміну в сироватці крові хворих на КРР при обтураційній товстокишковій непрохідності представляє значний інтерес для оцінки ступеня тяжкості перебігу хвороби та обґрунтування об’єму хірургічного лікування.

Матеріали і методи дослідження.

Програма дослідження включала визначеня у хворих на КРР з обтураційною товстокишковою непрохідністю у крові вмісту дофаміну, серотоніну, а у тромбоцитах – моноамінооксидази (МАО-В).

Першу (І) дослідну групу склали n=30 хворих (16 чоловіків і 14 жінок) з компенсованою непрохідністю, віком 63,5 ± 6,2 роки. До другої (ІІ) дослідної групи увійшли n=27 хворих (15 чоловіків і 17 жінок) з субкомпенсованою непрохідністю, віком 68,4±8,2 роки. Контрольна група «умовно здорові» включала n=23 пацієнти (12 чоловіків і 11 жінок), віком 64,3 ±7,8 років.

Активність МАО-В досліджували за швидкістю утворення продукта реакції дезамінування – бензальдегіду [5]. Кров забирали з 5% розчином ЕДТА. Виділення збагаченої тромбоцитами фракції проводили за допомогою центрифугування (10 хвилин при 1000 обертів/хвилину). Для визначення активності ферментів проби поміщали у пробірки об’ємом 1 мл зі скляним притертим корком. Інкубаційна суміш складалась із 0,2 мл 1М розчину бензиламіну, 0,3 мл 0,15М розчину NaCl і К-Na-фосфатного буферу і 0,5-1 мг білку. Пробірки інкубували при температурі 37^оС протягом однієї години. Реакцію зупиняли 4н НСІО₄. Утворений бензальдегід екстрагували 3 мл н-гексана. Верхню фазу відбирали шприцом і визначали концентрацію за допомогою спектрофотометра при довжині хвилі l=241нм. Питому активність (нмоль/мг білку за хвилину) розраховували за певною формулою. Вміст білку визначали методом Лоурі.

Визначення концентрації дофаміну в крові здійснювали спектрофлуориметричним методом на спектрофотометрі «Хітачи-МПР-4». Кров забирали з 5% розчином ЕДТА. Для визначення дофаміну відбирали 1 мл плазми, осаджували білок 1мл 20% ТХУ і центрифугували 15 хвилин при 5000об/хв. Надосадочну рідину зливали у пробірку з притертим корком, додавали 3 мл Н-бутанолу, струшували 15 хвилин. Потім центрифугували 5 хвилин при 3000 об/хв. Органічну фазу видаляли, а у водній фазі визначали вміст дофаміну. Флуоресценцію дофаміну спостерігали на довжині хвилі l=435 нм при довжині збудження l=340 нм.

Визначення вмісту загального серотоніну в крові здійснювали наступним чином: кров забирали з 5% розчином ЕДТА. До 0,5 мл плазми додавали 0,5 мл Н₂О і осаджували білок. Для визначення брали 1 мл 20% ТХУ і центрифугували 15 хв. при 5000 об/хв. Надосадочну рідину зливали у пробірку з притертим корком, додавали 2,5 мл н-бутанолу, стряхували 15 хвилин на електричній качалці. Потім центрифугували 5 хв. при 3000 об/хв. Бутаноловий шар переносили у пробірку і додавали 5 мл гептану. Струшували 15 хв., центрифугували 5 хв. при 3000 об/хв. Органічну фазу удаляли, а у водній фазі, куди додавали 0,2 мл 0,1% L-цистеїну у 0,1 NHCl і 1,8 мл 0,004% розчину о-фталієвого альдегіду у 10 NHCl, досліджували серотонін. Пробірку розташовували на киплячій водяній бані на 15 хв., потім охолоджували у проточній воді. Одночасно готували стандартний розчин серотонін – креатин сульфату. До 0,4 мл стандарту прибавляли 0,2 мл 0,1% розчину цистеїну і 1,8 мл 0,004% розчину о-фталієвого альдегіду в 1,0 NHCl. На спектрофотометрі «Хітачи» спостерігали флуоресценцію серотоніну на довжині хвилі l=480 нм при довжині хвилі збудження l=360 нм. Вміст серотоніну визначали з урахуванням, що 23 мкг серотонін-креатин сульфату відповідає 10 мкг чистого серотоніну.

Статистичний аналіз проводився з використанням методів варіаційної статистики і оцінкою вірогідності за t-критерієм Ст’юдента-Фішера.

Результати дослідження і їх обговорення.

Результати дослідження (табл.) показали, що вміст дофаміну у крові хворих до лікування був знижений у 2,95 ( на 66,2%) і 4,53 рази (на 78%) відповідно при компенсованій і субкомпенсованій стадіях товстокишкової непрохідності у порівнянні з показниками групи «умовно здорові». Після хірургічного лікування спостерігалось деяке підвищення цього показника, проте далеко не досягаючи значень умовно здорової групи.

Рівень серотоніну навпаки був підвищеним у порівнянні з контролем: до лікування – у 1,94 рази (на 94%) і у 2,65 рази (на 165%) відповідно при компенсованій (ІІІ стадія) і субкомпенсованій (ІV стадія) обтураційній непрохідності. Після лікування концентрація серотоніну знижувалась на 26,4% і 28,9% у порівнянні з показниками до лікування.

Таблиця

Вміст біогенних моноамінів у плазмі крові та активність тромбоцитарної моноамінооксидази у хворих на КРР до і після хірургічного лікування

Показники	Група спостереження; М±m
	Умовно здорові (n=23)	Компенсована обтураційна непрохідність (ІІІ стадія), n=30		Субкомпенсована обтураційна непрохідність (ІVстадія), n=27
		До лікування	Після лікування	До лікування	Після лікування
Дофамін (мкмоль/л)	0,68±0,05	0,23±0,022*	0,35±0,016*	0,15±0,012*	0,28±0,019*
Серотонін (мкмоль/л)	0,37±0,02	0,72±0,06*	0,53±0,03*	0,98±0,08*	0,76±0,05*
МАО-В (нмоль/мг білку·хв)	0,54±004	0,81±0,07*	0,69±0,04*	0,97±0,09	0,72±0,06*

Примітка: * – різниця з показниками групи «умовно здорові» вірогідна, р<0,05.

Активність моноамінооксидази тромбоцитів (МАО-В) була значно підвищена у хворих як до, так і після лікування. При компенсованій стадії обтураційної непрохідності до лікування її показники були підвищені у 1,5 рази (на 50%), а після хірургічного лікування у 1,28 рази (на 28%) у порівнянні з групою «умовно здорові». Активність МАО при субкомпенсованій стадії непрохідності була підвищена у 1,79 рази (на 79,6%) до лікування, а після лікування у 1,33 рази (на 33%) у порівнянні з контролем.

Дослідження показують, що хірургічне лікування хворих у деякій мірі приводить до позитивної динаміки показників, але вони залишаються вірогідно відмінними від аналогічних показників умовно здорової групи спостереження. Таким чином, у хворих на КРР спостерігається пригнічення активності дофамінергічної медіаторної системи на фоні активації серотонінергічної системи, що свідчить про дисфункцію дезамінування біогенних моноамінів та ерготропних і трофотропних метаболічних процесів. Аналіз результатів показує, що моніторинговим показником ефективності лікування може бути рівень серотоніну в плазмі крові, а показником ступеню тяжкості перебігу обтураційної товстокишкової непрохідності при КРР – рівень дофаміну.

Література

1. Акопян А.А., Арутнян М.В., Агавелян А.М. Роль моноаминооксидазы в патологии толстой кишки // Вопросы мед. химии, 1994. – Т.40, №6. – С.54-57.

2. Горкин В.З., Овчинникова Л.Н. Система аминооксидаз: современные достижения в исследовании природы, функций и их нарушений // Вопросы мед. химии. 1993, – Т.39, №4. – С. 2-10.

3. Ашмарина И.П., Ступалова П.В. Нейрохимия. – М.: Наука, 1996. – 427 с.

4. Горошинская И.А. Роль моноаминооксидазы в реакции организма на экстремальное воздействие. Дисс. на соиск. уч. степ. д.б.н. Ростов-на-Дону, 1998. – 411с.

5. Волошина О.Н., Москвитина Т.А. Способ определения моноаминоксидазной активности тромбоцитов // Лабораторное дело, 1985. – №5. – С. 289.