Д.мед.н., д.б.н. Жуков В.И., к.мед.н. Багмут И.Ю.*,

д. мед н. Наконечная О.А., Артюгина Л.И., к.мед.н. Оветчин П.В.

Харьковский национальный медицинский университет (г.Харьков)

*Харьковская академия последипломного образования (г. Харьков)

Влияние олигоэфирмоноэпоксида и олигоэфирциклокарбоната на окислительно-восстановительные и энергетические процессы в подостром опыте

В последнее время возросла доля отрицательного влияния на биосферу химической промышленности органического синтеза [10]. Трудно найти уголок планеты, на котором не отразилась бы деятельность человека [4,6]. За последние десятилетия синтезированы новые химические вещества, зачастую химически стойкие, высокотоксичные, обладающие выраженой биотроп-ностью, к которым животный и растительный мир эволюционно не адапти-рован [5]. Физические и химические вредные факторы наложили свой отпечаток на биосферу [11]. В связи с этим, естественная среда обитания человека сейчас стала носить относительный характер, так как даже промежуток времени в 10 лет приводит к формированию новой экологической ситуации и связан, прежде всего, с интенсивным ростом и развитием различных отраслей промышленности. Человек создал и продолжает создавать такие условия труда и быта, которые ограничивают или суживают диапазон влияния на его организм факторов природной окружающей среды. Адекватный ответ организма на воздействие вредных источников – это основа физиологически полной и своевременной адаптации к изменениям, происходящим в среде обитания человека, что является залогом сохранения здоровья. Вместе с тем, длительное и отрицательное влияние на организм химических факторов в субтоксических дозах, способно привести к нарушению гомеостаза, срыву адаптационных механизмов и развитию болезни. Это в полной мере относится к химической промышленности органического синтеза, которая создает ведущую антропогенную нагрузку на человека и биосферу. Наши знания о возможных последствиях их воздействия ограничены и явно недостаточны, особенно для тех веществ, с которыми человек прежде не встречался. В этой связи актуальным является изучение влияния химических соединений на метаболические процессы, обоснование механизмов их повреждающего действия на организм.

Целью работы явилось изучение влияния субтоксических доз олигоэфирциклокарбоната (ОЭЦ) и олигоэфирмоноэпоксида (ОЭМ) на окислительно-восстановительные и энергетические процессы в условиях подострого эксперимента у белых крыс.

Материалы и методы исследования. В работе была использована новая группа олигоэфиров на основе этиленоксида (ОЭМ –П-512–2-100) и оксипро-пилена (ОЭЦ – П-803), имеющая товарное название «Полиолы». На основании оценки параметров токсичности эти вещества относятся к малотоксичным соединениям (4 класс опасности), не обладающим кумулятивными свойствами [4,6,10]. Среднесмертельные дозы (ДЛ₅₀) были установлены на уровнях 26,70 и 18,75 г/кг массы животного, а коэффициенты кумуляции (Кк) на уровнях 9,28 и 7,82 соответственно для П–512–100 и П–803. Выбор соответствующих «Полиолов» был обоснован отсутствием сведений в научной литературе о механизмах их биологического действия и необходимостью получения прогностической характеристики потенциальной опасности для человека. Программа исследований предусматривала проведение подострого токсикологического опыта на половозрелых белых крысах популяции WAG (массой 180-200 г). Опытным животным на протяжении 45 суток ежедневно утром, до кормления, внутрижелудочно с помощью металлического зонда вводились водные растворы исследуемых веществ из расчета 1/100; 1/1000 ДЛ₅₀. Контрольная группа животных (n=10) получала соответствующие объемы питьевой воды. В эксперименте было использовано 50 белых крыс с соблюдением правил биоэтики и принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для научных и других целей» (Страсбург, 1985г). По окончанию подострого опыта определялось состояние тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования, содержание неорганического фосфора, АМФ, АДФ, АТФ, циклического аденозинмоно-фосфата (цАМФ), циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), малонового диальдегида (МДА), диеновых конъюгатов (ДК) и активности каталазы, супероксиддисмутазы (СОД). Для оценки дыхания митохондрий и окислительного фосфорилирования определяли скорость потребления кислорода в присутствии акцептора (V₃). В этом метаболическом состоянии митохондрий содержится избыток субстрата окисления и АДФ и отмечается наибольшая интенсивность их дыхания. На следующем этапе исследовалось потребление кислорода митохонодриями после добавления сукцината (V₄), а также после исчерпания добавляемого АДФ в присутствии разобщителя – 2,4 – динитрофенола (2,4-ДНФ) – метаболическое состояние (V₄¹), которое характе-ризуется дефицитом одной АДФ. Это состояние называют контролируемым, и оно отличается низкой интенсивностью дыхания. При этом рассчитывали:

1.Соотношение АДФ/О₂, отражающее сопряженность процессов окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи; 2. Дыхательный коэффициент Ларди (ДК) - отношение скорости поглощения кислорода в соотношении «V₃» к скорости поглощения кислорода в состоянии «V₄» (до ввода в ячейку АДФ); 3. Активность АТФ-гидролазных реакций, как отношение V₄/V₄¹, характери-зующее скорость регенерации АДФ после его фосфорилирования. В качестве субстрата окисления использовали сукцинат [14]. Определение Са²⁺, Мg²⁺ - зависимой АТФ-азы в гепатоцитах осуществлялось общепринятым методом [8]. Содержание АТФ в тканях печени исследовали по методу E.Beutler [13], АДФ по методу D. Jaworek [15], креатинфосфата по методу Е.Д. Сонина [9] и неорганического фосфата по методу, описанному Н.П. Мешковой и С.Е. Севериным [8]. После получения результатов вычисляли значения энергети-ческого потенциала (ЭП) по формуле D.E. Atrinson [12]. Известно, что реализа-ция энергетического метаболизма во многом реализуется через систему вторичных медиаторов – цАМФ, ц ГМФ, которые определяют взаимосвязь анаболических и катаболических процессов. В ткани печени цАМФ и цГМФ определяли по методу A. Steiner et al. [16]. Состояние оксидантно-антиоксидантного взаимодействия оценивали по содержанию в печени МДА МДА, ДК и активности ферментов СОД, церулоплазмина, каталазы в сыворотке крови. Определение МДА и ДК определяли по методу, описанному Ю.А. Владимировым и А.И. Арчаковым [3]. Активность каталазы в печени исследовалась по методу, который основан на способности двух молекул Н₂О₂ разлагаться каталазой на воду и О₂ [1]. Активность СОД в печени определяли по методу [2]. Содержание церулоплазмина исследовали по методу Раввина [7]. Полученные результаты обрабатывались методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента-Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение. Результаты изучения энергетического обмена у белых крыс, подвергшихся пероральному воздействию ОЭМ и ОЭЦ в дозе 1/100 ДЛ₅₀, обнаружили существенное инигибирование тканевого дыхания и окисилительного фосфорилирования. Доза 1/1000 ДЛ₅₀ не оказывала влияние на показатели энергетического обмена (табл. 1). Исследуемые олигоэфиры в 1/100 ДЛ₅₀ снижали дыхание митохон-дрий после добавления сукцината на 30,3% и 22,5% (V₄), после добавления АДФ (V₃) - на 48,3% и 49%, при внесении разобщителя 2,4 – ДНФ - на 46% и 49,6% соответсвенно в группах животных, которые подвергались затравке П – 512–100 и П–803. ДК у крыс снижался по сравнению с контролем на 25,7% и 34,7%, а коэффициент фосфорилирования - на 66% и 52%, соответственно при действии П–512–100 и П– 803 (табл. 1). На этом фоне наблюдалось инги-бирование активности Мg²⁺- АТФазы на 34,8% и 34,5%, Са²⁺ - АТФазы - на 35% и 22,4% и Н⁺-АТФазы - на 46,6% и 49,8%. Важнейшим условием функционирования восстановительных синтезов, являются энергетические процессы и связанные с ними сопряженные системы тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования, которое сопровождается образованием АТФ из АДФ и неорганического фосфата [14,8]. Исследования обнаружили снижение активности фермента сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в митохондриях опытных животных, что подтверждалось ингибированием дыхания после добавления сукцината.

Таблица 1. Влияние олигоэфиров в подостром опыте на метаболическую активность митохондрий гепатоцитов

Показатели	Вещества, М±m, ДЛ50
	Контроль	П – 512-2-100		П - 803
		1/100	1/1000	1/100	1/1000
Дыхание митохондрий после добавления сукцината (V4)^a	1,78±0,27	1,24±0,07*	1,75±0,2 2	1,38±0,09*	1,82±0,25
Дыхание после добавления АДФ (V3)^a	6,2±90,43	3,25±0,26*	6,38±0,57	3,20±0,35*	6,43±0,51
Дыхание после добав-ления разобщителя 2,4- ДНФ (V4^1)^a	7,42±0,64	3,94±0,17*	7,32±0,46	3,74±0,28*	7,28±0,46
ДК=V3/V4, отн. ед	3,52±0,35	2,62±0,12*	3,64±0,39	2,30±0,22*	3,53±0,38
АДФ/О2	2,84±0,32	1,25±0,08*	3,10±0,28	1,36±0,07*	2,75±0,36
Мg^2+ - АТФаза^b	83,26±5,17	54,26±3,15*	81,65±6,10	53,74±4,25*	82,65±5,40
Са^2+- АТФаза^b	71,40±4,23	46,35±4,43*	69,38±5,23	48,27±3,62*	68,36±4,82
Н^+- АТФаза^b	76,52±3,86	40,86±3,75*	74,80±4,15	38,42±4,10*	73,76±6,23

Примечание: ^a - нмоль О₂/мин·мг белка, ^b - мкмоль Р/мг белка· 1 час,

* - различия достоверные, р<0,05

Учитывая тесную структурно-метаболическую связь этого фермента с внутренней мембраной митохондрий, можно судить, что олигоэфиры нарушают структурно-функциональное состояние митохондриальных мембран гепатоцитов. Анализ метаболической активности митохондрий контрольной группы животных обнаружил достаточно высокий уровень их энергетического состояния. Так, добавление акцептора в состоянии V₃ и дополнительно разобщителя 2,4 – ДНФ в состоянии V₄ обнаружило увеличение скорости дыхания в присутствии сукцината и АДФ, связанного со снижением мембранного потенциала в контрольной группе животных [8, 14]. Олигоэфиры в 1/100 ДЛ₅₀ подавляли дыхание митохондрий после внесения АДФ и разобщителя, а также снижали ДК и КФ. При этом ДК в контрольной группе составлял 3,52±0,35 отн. ед., что свидетельствовало о высоком уровне энергетического состояния митохондрий гепатоцитов животных контрольной группы. Известно, что снижение дыхания митохондрий в метаболическом состоянии V₃ отражает сопряженность дыхательной активности электронно-транспортной цепи при функционировании Н⁺-АТФазы [8]. Исследования выявили, что олигоэфиры в 1/100 ДЛ₅₀ подавляют дыхание и окислительное фофорилирование на фоне повышения доли свободного дыхания. Об этом свидетельствовало снижение интенсивности дыхания в безакцепторной среде и в третьем метаболическом состоянии (V₃) после добавления АДФ. Вместе с тем исследования показывают, что снижение ДК и КФ дают основания судить о разобщении процессов окисления и фосфорилирования [8,14]. Анализ результатов обнаружил, что регенерация АДФ при оценке АТФ – гидролазной реакции заметно снижается в опытных группах животных сравнительно с контролем. Значительное ингибирование дыхания в состоянии V₃ указывает на снижение интенсивности реакций окислительного фосфорилирования, что может быть связано с нарушением структуры мембран митохондрий и их фрагментации. Эти данные подтверждались также снижением активности ферментов Са²⁺ - АТФазы, Мg²⁺ - АТФазы, Н⁺ - АТФазы. Поскольку активность АТФаз митохондрий связывают с процессами окисления и фосфорилирования, то следует ожидать, что олигоэфиры являются разобщителями этих процессов. Снижение активности Н⁺ - АТФ – синтетазы, наблюдаемое при субтоксической интоксикации ксенобиотиками, является одними из ведущих звеньев в цепи разобщения окисления и фосфорилирования, а, следовательно, уменьшения энергопродукции АТФ и восстановительных синтезов [4,8]. Исследование содержания в печени макроэргических соединений и метаболитов энергетического обмена обнаружило снижение под влиянием 1/100 ДЛ₅₀ олигоэфиров АТФ, АДФ и повышение АМФ и неорганического фосфата (табл.2). Вещества в 1/1000 ДЛ₅₀ не оказывали влияние на эти показатели. Так, олигоэфиры в 1/100 ДЛ₅₀ снижали содержание в печени АТФ на 67% и 68,5%, АДФ - на 50% и 51,8% на фоне повышения АМФ на 70,5% и 82,%, а неорганического фосфата - на 47,3% и 50% соответственно под влиянием П– 512–100 и П–803. Анализ динамики внутриклеточных медиаторов выявил повышение уровня цАМФ и снижение цГМФ. Циклический АМФ повышался на 38,7% и 42,2%, а циклический ГМФ снижался в печени на 38,7% и 44,2% соответственно у групп животных, подвергавшихся воздействию П–512–2 - 100 и П–803. Эти результаты свидетельствуют о возможном преобладании катаболических процессов над анаболическими синтезами. Сумма адениловых нуклеотидов (АТФ+АДФ+АМФ) и содержание креатинфосфата существенно снижались в печени опытных групп животных сравнительно с контролем. Адениннуклеотиды под влиянием 1/100 ДЛ₅₀ снижались в печени на 35,5% и 35%, а креатинфосфат - на 58,2% и 54,8% соответственно у групп животных, токсифицированных П–512–100 и П–803. Подавление процессов биоэнергетики подтверждалось также снижением энергетического потенциала гепатоцитов, который ингибировался на 44,7% и 46,2% соответственно под влиянием П – 512–2–100 и П–803.

Таблица 2. Влияние олигоэфирмоноэпоксида и олигоэфирциклокарбоната в подостром опыте на энергетический метаболизм

Показатели	Вещества, М±m, ДЛ50
	Контроль	П – 512-2-100		П - 803
		1/100	1/1000	1/100	1/1000
АТФ^a	2,16±0,08	0,71±0,04*	2,20±0,07	0,68±0,05*	2,14±0,06
АДФ^a	1,14±0,05	0,57±0,03*	1,16±0,07	0,55±0,03*	1,18±0,08
АМФ^a	0,78±0,03	1,35±0,06*	0,77±0,08	1,42±0,07*	0,75±0,06
Неорг. фосфор^a	6,28±0,43	9,250,54*	6,20±0,52	3,48±0,68*	6,33±0,47
цАМФ, нМ/г печени	630,4±37,5	874,3±38,5*	645,3±42,7	896,7±43,2*	628,7±32,5
цГМФ, нМ/г печени	35,30±6,21	21,65±2,73*	38,4±5,20	19,68±1,85*	36,9±4,80
Сумма адениннук-леотидов^a	4,08±0,08	2,63±0,04*	4,13±0,07	2,65±0,05*	4,07±0,06
Креатинфосфат^a	1,15±0,05	0,48±0,03*	1,16±0,07	0,52±0,03*	1,14±0,06
Энергетический потенциал	0,669±0,05	0,37±0,03*	0,67±0,07	0,36±0,03*	0,67±0,06

Примечание: ^a - мкмоль/г печени, * - различия достоверные, р<0,05

Изучение состояния окислительно-восстановительных процессов под влиянием 1/100 ДЛ₅₀ обнаружило активацию оксидантно - антиоксидантных процессов. Они проявлялись повышением содержания МДА, ДК в печени и активности СОД и каталазы. В сыворотке крови отмечалось, также, повышение острофазового белка - церулоплазмина (табл. 3). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что олигоэфиры в 1/100 ДЛ₅₀ стимулируют перекисное окисление липидов и свободнорадикальные процессы на фоне активации антирадикальной и антиперекисной защиты. В дозе 1/1000 ДЛ₅₀ исследуемые вещества не влияли на состояние оксидантно-антиоксидантного гомеостаза.

Таблица 3. Влияние олигоэфирмоноэпоксида и олигоэфирциклокарбоната на состояние антиоксидантной системы в подостром опыте

Показатели	Вещества, М±m, ДЛ50
	Контроль	П – 512-2-100		П - 803
		1/100	1/1000	1/100	1/1000
МДА^a, печень	51,72,4	172,410,5	52,33,7	168,78,3	49,82,63
МДА^b, сыворотка	5,150,42	14,80,9	4,860,34	15,31,1	4,970,46
Церулоплазмин (мг/л)	386,321,7	685,435,6	375,230,4	710,832,3	404,530,2
ДК^b, сыворотка	24,31,65	45,93,7	22,72,14	47,34,10	25,62,10
Каталаза (ед. акт), печень	7,350,46	15,71,3	7,250,58	16,21,4	7,210,43
СОД (ед.акт), печень	1,850,14	9,731,2	1,930,17	10,60,95	1,860,19

Примечание: ^a - мкмоль/г, ^b - мкмоль/л, * различия достоверные, р<0,05

Результаты исследования позволяют сделать следующие выводы:

1. Олигоэфиры П–512–100 и П–803 в условиях подострого эксперимента способны под влиянием 1/100 ДЛ₅₀ ингибировать тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование на фоне разобщения этих процессов и снижения синтеза АТФ. В 1/1000 ДЛ₅₀ вещества не нарушают биоэнергетический гомеостаз;

2. Исследуемые олигоэфиры под влиянием 1/100 ДЛ₅₀ снижают резервы макроэргических соединений (АТФ, АДФ, креатинфосфат) и повышают содержание АМФ и неорганического фосфата на фоне ингибирования энергетического потенциала и преобладания катаболических процессов над анаболическими синтезами;

3. Олигоэфиры П–512–2–100 и П–803 под воздействием 1/100 ДЛ₅₀ активируют свободнорадикальные процессы, перекисное окисление липидов и систему антирадикальной и антиперекисной защиты на фоне усиления острофазной воспалительной реакции. Недействующей дозой по влиянию олигоэфиров на метаболические и биоэнергетические процессы является 1/1000 ДЛ₅₀.

Литература

1. Архипова О.Г. Методы исследования в профпатологии ∕ О.Г. Архипова.– М.: Медицина, 1988. – 207 с.

2. Брусов О.С. Влияние природных ингибиторов радикальных реакций на автоокисление адреналина ∕ О.С. Брусов, А.М. Герасимов, Л.Ф.Панченко // Биол. экспер. биол. и мед. – 1976. - №1. – С. 33-35.

3. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах ∕ Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. – М.: Наука, 1972. – 236 с.

4. Жуков В.И. Медико-биологические аспекты проблемы охраны водных объектов от загрязнения поверхностно-активными веществами ∕ В.И. Жуков, Р.И. Кратенко, Ю.К. Резуненко [и др.] // Медико-биологические аспекты проблемы охраны водных объектов.– Харьков: «Торнадо». – 2000. – 394 с.

5. Жуков В.И. Эколого-гигиеническая характеристика азотсодержащих поверхностно-активных веществ как загрязнителей водоемов ∕ В.И. Жуков, В.В. Мясоедов, С.А. Стеценко [и др.]. – Харьков «Торнадо», 2000. – 180 с.

6. Жуков В.И. Биологическая активность детергентов – производных нонилбензолов в связи с проблемой охраны водных объектов ∕ В.И.Жуков, С.А. Стеценко, Пивень В.И. [и др.]. – Белгород: «Белвитамины». - 2000. – 237 с.

7. Колб В.Г. Справочник по клинической биохимии ∕ В.Г. Колб, В.С. Камышников. Изд-во: Беларусь, Минск. - 1982. - 366 с.

8. Мешкова Н.П. Практикум по биохимии ∕ Н.П. Мешкова, С.Е. Северин.– М.: МГУ, 1979. – 428 с.

9. Сонин Е.Ф. Основы биохимии мышц ∕ Е.Ф. Сонин. – К.: Изд-во Киевского университета. - 1960. – 181 с.

10. Циганенко А.Я. Научные основы обоснования прогноза потенциальной опасности детергентов в связи с регламентацией в воде водоемов / А.Я. Циганенко, В.И.Жуков, Н.Г.Щербань [и др.]. – Белгород, 2001. – 422 с.

11. Циганенко А.Я. Эколого-гигиеническая характеристка детергентов на основе алкилфенолов, изозонилфенолов и вторичных спиртовых фракций С_10-20 как загрязнителей водоемов ∕ Циганенко А.Я., Шаповал Л.Г., Зовский В.Н., Щербань Н.Г. [и др.]. – Белгород «Белвитамины», 2000. – 170 с.

12. Atrinson D. E. The energy charge of the adenylate pools as a repylatory parameter. Interaction With ofeedback modifiers ∕ D. E. Atrinson // Biochemistry. – 1968. – Vol. 7. - № 41. – P. 4030 – 4034.

13. Beutler E. Method of enzymatic analysis ∕ E. Beutler //New York. – 1975. – Vol. 1. - № 3. – P. 565 - 566.

14. Chance B. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation J. kinetics of oxyden utilization ∕ B.Chance, G.R. Williams.– J. Biol. Chem. -1955. - Vol. 217. - № 1. - P. 383 - 395.

15. Joworek D. Adenosin–5–diphosphat and Adenosin–5–monophosphate ∕ D.Joworek, W.Gruber, H.U.Bergmeyer // Jn: Bergmeyer H.V. (ed). Methoden der enzymatishen analyse. – Bd. П.Wierhheim//Cnemic. – 1974. – P. 2174-2181.

16. Steiner A.L. Radioimmunoassay for measurement of cyclic nucleotides ∕ A.L. Steiner, R.E. Wehmann, Parker Ch.W. // Advances in cyclic nucleotides research. – Raven Cress. H.J. – 1972. – Vol. 2. – P. 51-52.