Медицина/8.Морфология

д.м.н. Стручко Г.Ю., К.м.н. Москвичев Е.В., д.м.н. Меркулова Л.М., к.м.н. Кострова О.Ю., к.м.н. Михайлова М.Н.

ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова»,

кафедра нормальной и топографической анатомии, г. Чебоксары, Россия

Использование аутотрансплантации фрагмента селезенки для коррекции постспленэктомического гипоспленизма и подавления биологической агрессивности злокачественной опухоли на фоне развившегося вторичного иммунодефицита

По данным статистики злокачественные новообразования являются одной из основных причин смертности среди взрослого населения, занимая третье место в ее структуре после болезней сердечно-сосудистой системы и травм и отравлений [7]. Только за 2011 г в России было выявлено более 522 тысяч новых случаев злокачественных новообразований. Абсолютное число заболевших в 2011 г более чем на 15% больше, чем в 2001 г. В структуре заболеваемости новообразования ободочной кишки занимают 5 место и составляют 6,5% [2].

Таким образом, неуклонный ежегодный рост числа больных с впервые установленным диагнозом злокачественной опухоли, значительная разница в заболеваемости и его приросте в различных регионах, в очередной раз указывают на необходимость более тщательного изучения механизмов развития опухоли, ее профилактики, диагностики и лечения.

За последние 15-20 лет достигнуты значительные успехи в исследовании иммунологии злокачественного роста и его иммунотерапии. Получены данные о том, что опухоли различных органов развиваются на основе выраженных иммунных нарушений, возникающих уже при предопухолевых заболеваниях [1,3,4].

Известно, что рост злокачественных новообразований, зачастую, сопровождается продукцией ими веществ, угнетающих защитные силы организма. Это в свою очередь приводит либо к снижению противоопухолевого иммунного ответа, либо к полному его блокированию [10]. При этом опухоль перестает распознаваться иммунными клетками как чужеродная или дефектная ткань, и становится биологически более агрессивной. Кроме подавления локального иммунного ответа, опухоль обладает прямым угнетающим влиянием на иммунные органы, что приводит к снижению ими продукции иммунокомпетентных клеток либо к выработке дефектных цитотоксических лимфоцитов, которые так же могут служить источником происхождения иммуносупрессивных клеток [8,9]. Однако механизм прямого супрессорного влияния опухоли на иммунные органы до конца не ясен.

В предыдущих наших работах было показано, что и спленэктомия (как модель развития вторичного иммунодефицита) и введение канцерогена приводят к выраженным иволютивным изменениям тимуса [6]. Однако выраженность изменений имела существенное отличие в этих экспериментальных группах. В работах другой серии было установлено, что опухоли толстой кишки, развившиеся на фоне иммунной недостаточности после спленэктомии, имеют боле низкую степень клеточной дифференцировки, достоверно более высокую клеточную пролиферацию, а также иные показатели неоангиогенеза и апоптоза по сравнению с изолированным введением канцерогена [5]. На основании этого целью настоящего исследования стало изучение биологической агрессивности опухоли толстой кишки на фоне коррекции постспленэктомического гипоспленизма путем аутотрансплантации фрагмента селезенки.

Материалы и методы исследования. Исследование проведено на 70 нелинейных крысах самцах. Животные были разделены на две группы: спленэктомированные с введением канцерогена, спленэктомированные с аутотрансплантацией селезенки и последующим введением канцерогена. Животным первой группы 4 месяцев в условиях анестезии с соблюдением правил асептики и антисептики, через разрез по белой линии живота животным выполнялась спленэктомия. Животным второй группы так же выполнялась спленэктомия, затем проводилась гетеротопическая аутотрансплантация фрагмента селезеночной ткани в большой сальник. Для этого из предварительно декапсулированной селезенки выкраивался фрагмент кубической формы размером 4х4х4 мм. Он ополаскивался в теплом стерильном физиологическом растворе, окутывался большим сальником и фиксировался кисетным швом. Через два месяца после операции животным обеих групп внутрибрюшинно вводили 1,2-диметилгидразин из расчета 20 мг/кг веса крысы 1 раз в неделю в течение 5 недель. Выведение животных из эксперимента проводилось через 3 и 5 месяцев после окончания курсового введения канцерогена. Объектом исследования служили новообразования толстой кишки. В работе применялись следующие методы: В работе использовались следующие методы:

1. Для иммуногистохимического исследования были использованы четыре коммерческих моноклональных антитела фирмы Santa Cruze, разделенных на группы по функциональной значимости: 1) маркеры пролиферативной активности – PCNA, Ki-67; 2) маркер апоптоза – bcl-2; 3) супрессор опухолевого роста – p53.

2. Гистологические срезы опухолевой и прилежащей к ней ткани толщиной 3-4 мкм были окрашены гематоксилином и эозином. На светооптическом микроскопе оценивали степень дифференцировки опухоли, характер изменений эпителия и желез.

3. Морфометрический метод с использованием пакета программ Sigma Scan Pro для определения ядерно-цитоплазматического соотношения и количественных характеристик иммуногистохимических реакций. Данные обрабатывались статистически, достоверность определялась t-критерием Стьюдента.

Результаты исследования и обсуждение. Через 3 месяца после окончания введения канцерогена у животных обеих групп идентичные утолщения слизистой оболочки кишки имеют полиповидную форму и выступают над уровнем слизистой на 1-2 мм. Полипы имеют широкое основание, более темный цвет по сравнению с окружающей слизистой и усиленный сосудистый рисунок. На поверхности отдельных полипов определяются поверхностного изъязвления, покрытые беловатым налетом. При микроскопическом исследовании новообразования толстой кишки на этом сроке соответствуют стадии аденоматозного полипа с признаками клеточной дисплазии различной степени. Пролифераты крипт, формирующие аденомы, характеризуются увеличением ядерно-цитоплазматического соотношения в пользу ядра. Отмечаются признаки клеточной атипии, что выражается в многорядности клеток желез, гиперхромии ядер, нарушении полярности ядра, появлением двуядерных клеток.

Установлено, что через 3 месяца после использования курса канцерогена предопухолевые изменения в толстой кишке у крыс обеих групп при схожести морфологической картины имеют некоторые отличия в молекулярном фенотипе. Это проявляется в достоверно более высокой экспрессии в аденомах белка-регулятора апоптоза p-53 в группе спленэктомированных крыс и животных с аутотрансплантацией селезенки по сравнению с животными с изолированным введением канцерогена.

Через 5 месяцев после окончания курсового введения канцерогена в толстой кишке у крыс обеих групп формируются одна, реже две опухоли. Опухоли имеют, преимущественно, эндофитный или циркулярный тип роста и глубокую инвазию в кишечную стенку с переходом на серозную оболочку и околокишечную жировую клетчатку. Размеры опухоли так же вариабельны, но чаще не превышают 1 см. Морфологически опухоли представлены аденокарциномой, преимущественно высокой и умеренной степени дифференцировки

По степени клеточной дифференцировки на долю высокодифференцированных форм приходилось 62% от общего числа опухолей у крыс с изолированным введением канцерогена, 59% опухолей - у крыс с аутотрансплантацией селезенки и лишь 48% опухолей - у спленэктомированных животных. Умеренно дифференцированные аденокарциномы составляли 38% у интактных животных, 41% - у крыс с аутотрансплантацией селезенки и 46% - у спленэктомированных крыс. На долю низкодифференцированных форм (включая солидную и слизистую аденокарциному) приходилось до 6 % раков у спленэктомированных крыс, тогда как у животных с аутотрансплантацией селезенки и с изолированным введением канцерогена подобный тип новообразований отсутствовал.

При сравнении экспрессии маркеров клеточной пролиферации в опухолях у животных трех групп был выявлен ряд достоверных отличий. Установлено, что высокую интенсивность клеточной пролиферации Ki-67 (более 50%) у крыс с изолированным введением канцерогена имеют 18% опухолей с GRADE 1 и 52% - c GRADE 2. В группе с аутотрансплантацией селезенки высокая клеточная пролиферация отмечена в 23% опухолей с GRADE 1 и лишь 48% опухолей - с GRADE 2. В группе спленэктомированных крыс высокая пролиферация опухолевых клеток отмечена в 21% опухолей с GRADE 1; в 78% - с GRADE 2 и в 100% - с GRADE 3.

Кроме того, выявлено, что опухоли, развившиеся на фоне вторичного иммунодефицита после спленэктомии, имеют более низкую степень клеточной дифференцировки и достоверно более высокий индекс клеточной пролиферации Ki-67 в умеренно и низко дифференцированных опухолях по сравнению с группой контроля, тогда как в группе с аутотрансплантацией селезенки и введением канцерогена достоверных отличий по сравнению с группой контроля на отмечено. Достоверных отличий в экспрессии другого маркера клеточной пролиферации PCNA в опухолях всех экспериментальных групп не выявлено.

Нами также было установлено, что в высокодифференцированных опухолях у крыс с изолированным введением канцерогена гиперэкспрессия белка p53 выявляется в 17% опухолей, в умеренно дифференцированных - в 33%. У крыс с аутотрансплантацией селезенки гиперэкспрессия p53 отмечена в 21% опухолей с GRADE 1 и 29% опухолей - с GRADE 2. В опухолях крыс с вторичной иммунной недостаточностью после спленэктомии гиперэкспрессия p-53 выявлялся в 20% высокодифференцированных опухолей, в 64% - с умеренной дифференцировкой и в 100% - низкодифференцированных новообразований.

У животных с аутотрансплантацией селезенки позитивная реакция к bcl-2 отмечена в 14% опухолей с GRADE 1 и в 17 % опухолей - с GRADE 2. В группе крыс с введением канцерогена после спленэктомии позитивную реакцию с bcl-2 давали 10% клеток высокодифференцированных опухолей, 28% клеток - умеренно дифференцированных опухолей и 17% клеток - опухолей низкой степени дифференцировки. Следует отметить, что позитивная реакция к bcl-2 отмечалась не только в цитоплазме опухолевых клеток, но и в многочисленных лимфоцитах в строме опухоли.

Таким образом, можно сделать заключение, что опухоли у крыс с аутотрансплантацией селезенки имеют менее агрессивную морфологию и иной молекулярный фенотип по сравнению с опухолями, сформировавшимися в условиях иммунной недостаточности после спленэктомии. Вероятно, это может быть обусловлено, в том числе, частичной компенсацией тафтсиновой недостаточности. Следовательно, аутотрансплантация селезенки может рассматриваться как перспективный метод коррекции недостаточности противоопухолевого иммунитета у животных с вторичной иммунной недостаточностью после спленэктомии.

Литература:

1. Долгих В.Т. Опухолевый рост / В.Т. Долгих. – М.: Медицинская книга, 2001. – 192 с.

2. Злокачественные заболевания в России в 2011 году (заболеваемость и смертность) / под ред. В.И. Чисова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. -М.: МНИИОИ им. П.А. Герцина, 2013. – 289 с.

3. Киселева Е.П. Механизмы инволюции тимуса при опухолевом росте / Е.П. Киселева // Успехи совр. биол. - 2004. - Т.124. - С. 102-114.

4. Москвичев Е.В. Экспериментальный канцерогенез в условиях приобретенного иммунодефицита / Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю., Стручко, И.С. Стоменская // Морфологические ведомости. - 2009. - №3-4. - С.72-75.

5. Москвичев Е.В. Иммуногистохимическая характеристика апоптоза и клеточной пролиферации в тимусе при экспериментальной опухоли толстой кишки / Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко // Иммунология. – 2012. - Т.33. - №6. - С. 303-305

6. Стручко Г.Ю. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика опухолей желудочно-кишечного тракта на фоне иммунной недостаточности / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев и др. // Вестник Чувашского университета. – 2011. - №3. - С. 450-456.

7. Чисов В.И. Современное состояние онкологии и перспективы её развития / В.И. Чисов // Российский онкологический журнал - 2000. - №4. - С. 50-54.

8. Mailloux A.W. Regulatory T-cell trafficking: from thymic development to tumor-induced immune suppression / A.W. Mailloux, M.R. Young // Crit. Rev. Immunol. – 2010 – Vol.30. - №5. - Р.435-447.

9. Stewart T.J., Smyth M.J. Improving cancer immunotherapy by targeting tumor-induced immune suppression / T.J. Stewart, M.J. Smyth // Cancer Metastasis Rev. – 2011. - Vol. 30. - №1. - Р.125-140.

10. Whiteside T.L. The role of immune cells in the tumor microenvironment / T.L.Whiteside // Cancer Treat. Res. – 2006. - Vol. 130. - P.103-124.