Перепадя С.В.
Харківська медична академія післядипломної освіти
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО
АНАЛИЗА СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНИМ РАКОМ
Вступ
Молекулярные
механизмы преобразования энергии в клетке тесно сопряжены с биоэнергетическим
гомеостазом, который отражает состояние окислительных и восстановительных
синтезов, обеспечивающих нормальное функционирование процессов
жизнедеятельности организма. При этом высвобождение химической энергии в виде
АТФ прочно связано с реакциями тканевого дыхания и окислительного
фосфорилирования [1]. С точки зрения медицины
важно, что многие патологические нарушения в организме (сахарный диабет,
опухолевый рост, тиреотоксикоз, псориаз, атеросклероз и др.) сопровождаются
разобщением окисления и фосфорилирования в митохондриях, которое отражает
изменение барьерной функции внутренней мембраны, физико-химических и
структурно-метаболических их свойств. Эти нарушения в большинстве случаев так
или иначе связаны с изменениями состава и свойств липидов в мембранах [2, 3, 4].
Известно четыре основных механизма модификации липидов, нарушающих сопрягающие
функции мембраны: перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот, расщепление
фосфолипидов митохондриальной фосфолипазой, механическое растяжение мембраны
(например, за счет избыточного осмотического давления внутри органелл или клеток) и изменение взаимодействий
липидов и белков (например, адсорбция чужеродных белков, изменения конформации белков и т.д.). Во всех этих процессах
важное значение принадлежит механизмам превращения энергии, выделяющейся в ходе
биохимических реакций, в энергию электронных возбуждений; электронной
структуре; электронным переходам и донорно-акцепторным свойствам
реакционно-способных молекул, а также путям превращения энергии возбужденного
состояния молекул в энергию химических связей [1, 4]. Решение этих научных
вопросов представляет большой интерес для раскрытия начальных пусковых
механизмов формирования патологических состояний, диагностика которых, позволяет
осуществлять своевременно и оперативно коррекцию нарушенных метаболических
процессов. Высокочувствительным и информативным методом диагностики
свободнорадикальных процессов, перекисного окисления липидов, энергетики
биохимических процессов, окислительной модификации белков, нуклеиновых кислот,
липопротеинов и др. является метод биохемилюминесценции [2, 3, 4]. Этот метод, обеспечивает
регистрацию электромагнитного излучения оптического диапазона различными
биологическими объектами и рассматривается
как один из основных, при изучении молекулярной энергетики биохических
реакций [4]. Многочисленные научные исследования свидетельствуют, что в условиях
развития онкопатологии наблюдаются нарушения кооперативного
ядерно-цитоплазматического взаимодействия, анаэробного и аэробного типов
биоэнергетики, оксидантно-антиоксидантного гомеостаза, которые являются
характерными для всех видов опухолей и являются общими патогенетическими
факторами при данной молекулярной патологии. Современные методы изучения
энергетики биохимических процессов, базируются на оценке состояния аэробных и
анаэробных процессов в организме [5, 6]. В широком спектре
исследований, показано высокий уровень соответствия, между метаболической
активностью митохондрий и содержанием в цитоплазме клеток пировиноградной
кислоты, лактата, α-кетоглутарата, сукцината, изоцитрата, оксалоацетата,
коферментных форм НАД+/НАД·Н2; АТФ/АДФ, ключевых
ферментов цикла Кребса, скоростью поглощения кислорода (О2) и др. [1, 5, 6, 7].
Некоторые авторы о состоянии биоэнергетики судили по функциональной активности
клеточных ядер буккального эпителия. Они показали тесную связь между
метаболической активностью, генотипом, содержанием в ядре ДНК, РНК, кислых
белков, АТФ, АДФ, биоэнергетикой, транскрипционной активностью ядерного генома,
степенью гетерохроматизации и электроотрицательностью клеточных ядер [8]. В последнее десятилетие
накопилось достаточно много сведений, которые свидетельствуют о тесной связи
внутриклеточного метаболизма и процессов биоэнергетики с физико-химическими и
структурно-метаболическими свойствами биологических мембран. Доказано, что
ведущим патогенетическим фактором развития мембранной патологии является
стимуляция свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов,
белков, нуклеиновых кислот и др., ведущих к повышению уровня в органах и тканях
активных форм кислорода, перекисей, гидроперекисей, свободных радикалов,
формирующих свободнорадикальную патологию [4, 9, 10]. По мнению многих ученых
эти процессы сопровождаются усилением скорости старения организма, гипоксией,
трансформацией нормальных клеток в злокачественные, ингибированием
биоэнергетики и разобщением окислительного дыхания и фосфорилирования [4, 10, 11].
Учитывая вышесказанное, целью работы явилось изучение интенсивности
биохемилюминесценции (БХЛ) сыворотки крови у больных колоректальным раком в
зависимости от локализации и распространенности опухолевого процесса при обосновании дифференцированного подхода
к объему хирургического вмешательства и оптимизации патогенетической терапии.
Состояние
биоэнергетического гомеостаза оценивалась у 239 пациентов страдающих на рак
толстого кишечника в возрасте от 35 до 66 лет. Диагноз был подтвержден
клиническими и гистологическими методами исследования. Рак прямой кишки (РПК)
был обнаружен у 54 пациентов, рак сигмовидной кишки (РСигК) у 62 человек, рак
слепой кишки (РСлК) у 27, рак поперечно-ободочной кишки (РПОК) у 66 и рак
толстой кишки (РТК) установлено у 30 больных. Из них, РПК выявлено у 29 муж. и
25 жен; РСигК у 33 муж. и 29 жен; РПОК у 48 муж. и 18 жен.; РТК у 17 муж. и 13
жен.; РСлК у 15муж. и 12 жен. В зависимости от стадии развития злокачественного
роста: первая установлена у 28 пациентов (это больные на полипоз толстого
кишечника); вторая – у 56, третья – у 122 и четвертая у 33 больных. Среди
больных мужчин на РПК – первая стадия выявлена у 6ти; вторая у 8и;
третья у 9ти и четвертая стадия определялась у 6и
пациентов. Из 62 больных онкопатологией при РСигК первая, вторая, третья и
четвертая стадия заболевания у мужчин определялась соответственно, у 3, 13, 11
и 6и человек, тогда как у женщин у 4, 7, 14 и 4х пациентов.
РПОК диагностировано у 5, 12, 27 и 4х
мужчин и у 2, 4, 9 и 3х женщин соответственно, с 1,
2, 3 и 4 стадией заболевания. РТК определено у 2, 3, 10 и 2 мужчин и у 1, 2, 9,
и 1 женщины соответственно, при 1, 2, 3 и 4ой стадии
опухолевого роста. РСлК диагностировано у 1, 1, 12 и 1го мужчины и у
1, 1, 9, и 1ой женщины
соответственно, при 1, 2, 3, и 4ой стадии канцерогенеза.
Сравнительную группу составляли 486 условно-здоровых пациентов, не
предъявляющих особых жалоб на состояние здоровья, аналогичного возраста и пола.
Методика исследования включала общепринятое в
медицинской практике взятие крови из локтевой вены (5,0 мл), получение
сыворотки крови и регистрацию интенсивности сверхслабой люминол-зависимой
индуцированной биохемилюминесценции сыворотки крови больных и условно-здоровых
пациентов. Последовательность определения интенсивности БХЛ сыворотки крови
была следующая (12): в 1,0 мл сыворотки крови при комнатной температуре вносили
50мкл 0,5% раствора люминола. После чего, кювету с сывороткой и внесенным
раствором люминола, помещали над фотоэлектронным умножителем (ФЭУ-130)
светонепроницаемой камеры стандартной установки медицинского хемилюминометра
ХЛМЦ1-01. Пробы сыворотки термостатировали до 37°С в биостате, затем измеряли
спонтанную (СБХЛ) и индуцированную (50мкл) 0,5% раствором Н2О2
биохемилюминесценцию (ИБХЛ) на протяжении 1й минуты. Интенсивность СБХЛ и ИБХЛ
регистрировали счетчиком фотонов и записывали на автоматическом потенциометре в
виде кривых хемилюминограммы. Статистическая обработка полученных результатов
исследования интенсивности люминол-зависимой
индуцированной биохемилюминесценции выполнялась с использованием методов
вариационной статистики и оценкой достоверности различий по Стьюденту-Фишеру.
Результаты интенсивности СБХЛ и ИБХЛ в зависимости
от локализации опухолевого процесса и пола не обнаружили достоверных различий
по сравнению с группой условно-здоровых пациентов (табл.1). Обращает на себя
внимание, тот факт, что у всех больных КРР отмечается большое отклонение
уровней БХЛ от средних значений, превышающие в некоторых случаях, более чем в 5
раз контрольные величины. Это позволило нам провести сравнение уровней
интенсивности БХЛ в зависимости от стадии развития опухолевого процесса и
степени тяжести заболевания (табл. 2).
Анализ интенсивности Н2О2
индуцированной люминол-зависимой БХЛ сыворотки 28 больных на колоректальный
рак (КРР) при первой стадии развития
патологического процесса, определил нижнюю и верхнюю границу сверхслабого
свечения. Нижняя граница соответствовала 496имп/сек, тогда как верхняя
находилась на уровне 943 имп/сек. Среднее значение интенсивности БХЛ для всей
группы, при первой стадии канцерогенеза равнялось 719,5±223,5имп/сек.
Исследования обнаружили, что в 46,7% случаев интенсивность индуцированной
люминол-зависимой БХЛ была выше показателей средней величины (752имп/сек)
условно-здоровой группы наблюдения, тогда как у 53,3% случаев эти значения были
гораздо ниже. Клинико-диагностические исследования позволили выявить у части
пациентов при первой стадии КРР наличие хронических воспалительных заболеваний
желудочно-кишечного тракта и органов дыхания, что могло повлиять на усиление
интенсивности сверхслабого свечения сыворотки крови определенной части больных.
Это в сою очередь и оказало существенное влияние на большой разброс интенсивности
БХЛ от средней величины (719,5±223,5имп/сек). В месте с тем, устойчивое падение
интенсивности БХЛ у 53,3% больных, свидетельствует об ингибировании процессов
биоэнергетики и окислительно-востановительных реакций при колоректальном раке
(табл.2). При второй стадии колоректального рака (56 случаев) индуцированная Н2О2
люминол-зависимая БХЛ сыворотки крови была в пределах от 406 до 503
имп/сек, средняя величина интенсивности (М±m) БХЛ соответствовала
452,5±48,7имп/сек. В 98% случаях интенсивность сверхслабого свечения находилась в
диапазоне колебаний от 400 до 500имп/сек, что указывало на еще более сильное
ингибирование процессов биоэнергетики у больных канцерогенезом при второй
стадии патологического процесса. Для третьей стадии развития опухолей толстого
кишечника (122 пациента), наблюдалось существенное снижение интенсивности БХЛ
по сравнению со второй стадией канцерогенеза. Нижний уровень БХЛ сыворотки
крови равнялся 298имп/сек, а верхний - соответствовал 395имп/сек. Средняя
величина (М±m) индуцированной БХЛ соответствовала 347,2±51,6имп/сек. Снижение
уровней интенсивности БХЛ имело тесную корреляцию с тяжестью заболевания,
стадией развития опухолевого процесса и биоэнергетикой (r=-0,97).
При четвертой стадии (33 пациента) КРР, пределы уровней интенсивности БХЛ
наблюдались в интервале от 298 до 199 имп/сек. Средняя величина соответствовала
248,5±49,7 имп/сек. У 98% случаев интенсивность индуцированной Н2О2
люминол-зависимой БХЛ была в границах от 200 до 300 имп/сек. Это
свидетельствовало о низкой метаболической активности и энергетики биохимических
реакций сыворотки крови.
Обобщение интенсивности Н2О2 индуцированной люминол-зависимой БХЛ
сыворотки крови (24 пациента) в терминальную фазу болезни, показало во всех
случаях, снижение сверхслабого свечения ниже
200имп/сек и было в пределах от 52 до 198 ипм/сек, при средних значениях
(М±m) 123,4±69,8имп/сек. Исследования показывают, что фоновые уровни
интенсивности БХЛ во всех случаях находились в диапазоне от 25 до 75 и были
равны 50±25 имп/сек. Это позволяет, для
объективной оценки
Интенсивность индуцированной люминол-зависимой БХЛ в зависимости от локализации опухолевого процесса
|
Группа наблюдения,
локализация (n) |
Интенсивность БХЛ (J°t), пол, М±m |
|||
|
мужчины |
женщины |
|||
|
СБХЛ |
ИБХЛ |
СБХЛ |
ИБХЛ |
|
|
РПК (n=54) |
163,7±82,5* n=29 |
820,3±468,5* n=29 |
161,4±79,3* n=25 |
830,6±452,3* n=25 |
|
РСигК (n=62) |
173,4±69,4* n=33 |
860,5±473,8* n=33 |
168,9±71,4* n=29 |
856,7±463,8* n=29 |
|
РСлК (n=27) |
182,9±77,3* n=15 |
810,4±462,3* n=15 |
175,6±83,4* n=12 |
805,2±470,6* n=12 |
|
РПОК (n=66) |
188,3±74,6* n=48 |
857,6±489,2* n=48 |
172,3±69,8* n=18 |
846,3±474,5* n=18 |
|
РТК (n=30) |
168,7±72,5* n=17 |
843,7±465,3* n=17 |
170,2±80,4* n=13 |
850,7±482,6* n=13 |
|
Условно-здоровые (n=486) |
137,4±8,6 |
752,0±164,0 |
131,7±10,3 |
745,8±153,6 |
Примечание:
* увеличение показателя, однако Р>0,05
результатов исследования, вычислить их от уровня нижней границы интенсивности сверхслабого свечения сыворотки крови. Данные показатели свидетельствуют о том, что в терминальную фазу опухолевого процесса, интенсивность БХЛ снижается практически до нуля имп/сек. Таким образом, интенсивность индуцированной люминол-зависимой БХЛ имеет прямую корреляционную связь с ингибированием процессов биоэнергетики и обратную зависимость со стадией развития канцерогенеза (r=0,97и - 0,98). Исследования выявили значительное снижение интенсивности индуцированной люминол-зависимой БХЛ при второй, третьей, четвертой стадии заболевания и в терминальную фазу болезни на 39,9%, 53,9%, 67% и 83,6% и более (табл. 2).
Таблица 2
Интенсивность индуцированной (Н2О2) люмино-зависимой БХЛ в зависимости от стадии развития опухолевого процесса при КРР
|
Группа наблюдения (n) |
Стадия КРР (n) |
Интенсивность люминол - зависимой БХЛ (J°c) |
||
|
|
Нижняя граница (имп/сек) |
Верхняя граница (имп/сек) |
Среднее значение (М±m) |
|
|
|
I-стадия n =28 |
496 |
943 |
719,5±223,5 |
|
Больные КРР n=239 |
II-стадия n = 56 |
406 |
503 |
452,5±48,7* |
|
|
III-стадия n = 122 |
298 |
395 |
347,2±51,6* |
|
|
VI-стадия n = 33 |
199 |
298 |
248,5±49,7* |
|
|
Терминальная фаза n = 24 |
52 |
198 |
123,4±69,8* |
|
Условно-здоровые n=486 |
|
588 |
916 |
752,0±164,0 |
Примечание: * различия достоверные Р<0,05
В месте с тем следует отметить, что достоверных различий в уровнях интенсивности индуцированной люминол-зависимой БХЛ между условно-здоровой группой и больными при первой стадии КРР, обнаружено не было, хотя их результаты в среднем и отличались при существенном отклонении значений уровней (М±m) сверхслабого свечения. Во всех остальных случаях наблюдалось значительное ингибирование сверхслабого свечения и энергетики биохимических процессов, при второй, третьей и четвертой стадии канцерогенеза (табл. 2). Таким образом, результаты изучения индуцированной люминол-зависимой биохемилюминесценции сыворотки крови, позволяют диагностировать состояние биоэнергетического гомеостаза, степень тяжести заболевания и стадию развития патологического процесса у больных колоректальным раком, что является прогностически значимым критерием при дифференцированном подходе к определению объема хирургического вмешательства и оптимизации патогенетической терапии. Ингибирование интенсивности сверхслабого свечения у больных раком толстого кишечника свидетельствует о развитии молекулярной патологии и снижении энергетики химических реакций, в основе которых лежит нарушение структурно-метаболического состояния митохондриальных, клеточных мембран и ядерно-цитоплазматических взаимодействий.
Литература:
1. Ленинджер А. Митохондрии
/А. Ленинджер // М.: Мир – 1966. – 315с.
2. Жуков В.И. Детергенты-модуляторы радиомиметических эффектов / В.И.
Жуков, В.В. Мясоедов, Ю.И. Козин и др.// Белгород, 2003. – 375с.
3. Григорова И.А. Этиология и
патогенетические механизмы модельного атеросклероза / И.А Григорова, Б.И.
Григоров, В.Н. Погорелов и др.// Харьков: РИП Оригинал., - 1997. – 254с.
4. Владимиров Ю.А. Перекисное
окисление липидов в биологических мембраннах./ Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков
//Москва: Наука, 1972. – 320с. 5. Скулачев В.П. Аккумуляция энергии в клетке
//В.П. Скулачев // М.: Наука. – 1959. – 439с.
6. Кондрашов М.Н.
Метаболическое состояние митохондрий и физиологическое состояние тканей / М.Н.
Кондрашов // В сб.: Свойства макромолекул и макромолекулярных систем. М. –
1969. – 135-140с.
7. Губин И.Е. Внутривидовая
изменчивость некоторых показателей энергетического обмена в митохондриях мышц
коров /И.Е. Губин // Весник ХНУ. Проблемы онтогенеза, гетерозиса и биоэкологии
животных. – Харьков, 1979. - №135. – с. 108-112.
8. Шахбазов В.Г. Влияние некоторых экстремальных факторов на
состояние клеточных ядер /В.Г. Шахбазов, В.Б. Аракелян, Г. Лебнити, К.
Рошлау// Весник ХНУ. Проблемы
онтогенеза, гетерозиса и биоэкологии животных. – Харьков, 1969, №135. – 57-
60с.
9. Строганова А.А. Сверхслабая люминесценция биологических
систем как вид информации о некоторых физиологических и патологических
процессах в организме//А.А. Строганова
//Педиатрия. – 1975. - №1. – с. 82-85.
10. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и хемилюминесценция в липидах
биологических мембран /Ю.А. Владимиров, В.И. Оленов, В.Б. Гаврилов//
Свободнорадикальное окисление липидов в норме и патологии. – М., 1976. – с.
30-31.
11. Владимиров Ю.А.
Флуоресцентные зонды в исследованиях биологических мембранах/ Ю.А. Владимиров,
Г.Е. Добрецов// М.: Наука, 1980. – 320с.
12. Пат 436578/25 ИАРФ
Устройство для регистрации при комнатной температуре люминесценции
биологических мембран/ В.М. Абашин, Н.Г, Сергиенко, В.И. Жуков и др. Опубл.
20.03.95. Бюл. №8.