М.А. Кучерявченко, О.В. Зайцева, В.И. Жуков, В.Г. Книгавко

Харьковский национальный медицинский университет, г. Харьков, Украина

СОСТОЯНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В МИТОХОНДРИЯХ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СУБТОКСИЧЕСКИХ ДОЗ ЛАПРОКСИДОВ

I. Вступление. Проблема химического загрязнения окружающей среды и рационального использования природных ресурсов является наиболее актуальной в условиях кризисного состояния биосферы. Интенсивная разработка и внедрение в производство новых технологических схем, широкий ассортимент химической продукции, быстрое наращивание производственных мощностей, размещение основных предприятий в густонаселенных местах приводит к формированию неблагоприятных условий проживания человека, что сопряжено с возникновением различных заболеваний и экологически обусловленных патологических состояний [5,10,12].

По мнению ряда авторов, многие ксенобиотики способны осуществлять модификацию клеточных белков, разрушать мембранные структуры за счет активации СРП и ПОЛ [2,3,6,9,11,13]. При этом особенно подчеркивается важная роль цитоплазматических мембран как активных регуляторов внутриклеточного метаболизма. Высокой чувствительностью к воздействию химических соединений обладают митохондриальные мембраны и их структурно-функциональные компоненты – белки, фосфолипиды, ферменты. В связи с тесным единством структуры, функций и метаболизма, поиск критериально-значимых показателей донозологической диагностики при формировании патологических процессов необходимо осуществлять, прежде всего, изучая особенности структурно-метаболических нарушений функционирования клеточных мембран.

Цель исследования. Изучить влияние малых субтоксических доз лапроксидов на метаболическое состояние митохондрий гепатоцитов и процессы биоэнергетики в условиях подострого токсикологического эксперимента.

II. Объект и методы исследования. Объектом исследования была выбрана новая группа химических веществ, имеющая товарное название “лапроксиды”, с регламентированными физико-химическими свойствами: олигоэфирмоноэпоксид молекулярной массы 500 (Л-500) и триглицидиловый эфир полиоксипропилентриола молекулярной массы 303 (Л-303). Данные вещества широко используются в различных отраслях народного хозяйства для получения пластмасс, пенопластов, эпоксидных смол, лаков, клеев и др. По результатам параметров острой токсичности исследуемые ксенобиотики являются малотоксичными и слабокумулятивными соединениями, не обладающими видовой и половой чувствительностью. Среднесмертельные дозы (LD50) Л-303 и Л-500 для белых крыс были установлены на уровнях 5,75 г/кг и 26,7 г/кг массы животного, что позволило отнести их к 4 классу опасности.

Программа исследования предусматривала проведение длительного подострого токсикологического опыта на половозрелых крысах линии Вистар массой 0,19-0,20 кг. В соответствии с условиями опыта, животным (n=60) на протяжении 1,5 месяца ежедневно утром, натощак, с помощью металлического зонда перорально вводились водные растворы лапроксидов в дозах 1/10, 1/100 и 1/1000 LD50. Контрольная группа животных (n=10) получала соответствующие объемы питьевой воды. В эксперименте строго соблюдались требования биоэтики и принципы «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для научных и других целей» (Страсбург, 1986г.) [4,14]. Забой животных осуществлялся путем декапитации с предварительной анестезией тиопенталом натрия.

По завершении подострого эксперимента изучалось метаболическое состояние митохондрий гепатоцитов в процессе развития структурно-метаболического повреждения ткани печени, вызванного действием лапроксидов. Для оценки дыхания митохондрий и окислительного фосфорилирования полярографическим методом [11] определяли скорость потребления кислорода в присутствии акцептора - (V3). В этом метаболическом состоянии митохондрий содержится избыток субстрата окисления и АДФ, что сопряжено с наибольшей интенсивностью их дыхания. На следующем этапе исследовалось потребление кислорода митохондриями после добавления сукцината - (V4), а также после исчерпания добавляемого АДФ в присутствии разобщителя – 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ) – метаболическое состояние (V4'), которое характеризуется дефицитом только АДФ. Это метаболическое состояние называют контролируемым, оно характеризуется низкой интенсивностью дыхания. При этом рассчитывали: отношение АДФ/О₂, дыхательный коэффициент Ларди, т.е. соотношение скоростей поглощения кислорода в состояниях V3 к V4 (ДК = V3/V4) и активность АТФ-гидролазных реакций. В качестве субстрата окисления использовали сукцинат.

Определение активности Ca²⁺-, Mg²⁺- и Н^t- зависимой АТФ-азы в митохондриях гепатоцитов осуществлялось общепринятым методом [7,8].

Полученные результаты обрабатывались методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента-Фишера.

III. Результаты исследований и их обсуждение. Результаты изучения влияния субтоксических доз лапроксида Л-303 на метаболические состояния митохондрий обнаружили, что при дозах 1/10 и 1/100 LD50 значительно снижается дыхание митохондрий (скорость потребления кислорода) после добавления субстрата окисления – сукцината (V4), дыхание после добавления АДФ (V3) и дыхание митохондрий после добавления разобщителя окисления и фосфорилирования – 2,4-ДНФ (V4¹) по сравнению с контрольной группой наблюдения (табл.). На этом фоне наблюдалось снижение величины ДК Ларди, коэффициента фосфорилирования, ослабление активности ферментов Ca²⁺-, Mg²⁺-зависимых АТФ-аз и Н⁺-АТФ-азы. Отсутствие статистических различий полученных результатов с показателями контроля при дозе 1/1000 LD50 Л-303 позволяет считать, что данная доза является недействующей на метаболическое состояние митохондрий гепатоцитов. Анализ исследований показал, что по сравнению с контролем дыхание митохондрий после добавления сукцината (V4) снижалось на 36,83% и 24,18%; после добавления АДФ (V3) - на 56,51% и 43,50%; после добавления разобщителя – 2,4-ДНФ (V4¹) - на 52,82% и 41,69%; величина ДК снижалась на 41,18% и 23,44%; коэффициента фосфорилирования - на 56,06% и 31,06% на фоне ингибирования активности Mg²⁺-АТФ-азы на 47,73% и 32,08%; Ca²⁺-АТФ-азы - на 46,07% и 40,56%; Н⁺-АТФ-азы – на 49,33% и 29,45% соответственно, у животных токсифицированных 1/10 и 1/100 LD50.

Оценка метаболического состояния митохондрий гепатоцитов животных, подвергавшихся токсификации Л-500 в дозах 1/10 и 1/100 LD50, обнаружила сходную динамику исследуемых показателей скорости потребления кислорода (табл.). Доза 1/1000 LD50 не оказывала воздействия на структурно-функциональное состояние митохондрий гепатоцитов. Полученные данные свидетельствуют, что лапроксиды снижают долю фосфорилирующего окисления в митохондриях гепатоцитов и увеличивают долю свободного дыхания.

Приведенные выше данные о нарушении функционального состояния митохондрий коррелируют с результатами исследования активности Ca²⁺-, Mg²⁺-зависимых АТФ-аз и Н⁺-АТФ-азы. Из таблицы видно, что ингибирование активности Н⁺-АТФ-азы митохондрий, также как и ингибирование дыхания, фосфорилирования и скорости АТФ-гидролазных реакций, зависит от дозы токсического воздействия лапроксидов на гепатоциты. Снижение активности Н⁺-АТФ-азы, наблюдаемое при токсификации животных лапроксидами, подтверждает данные о разобщении процессов окисления и фосфорилирования и, следовательно, ингибировании энергопродукции в этих условиях.

Одной из причин разобщения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях пораженных гепатоцитов может быть усиление накопления в них ионов кальция.

Увеличение скорости накопления кальция в митохондриях может быть сопряжено с повреждающим действием на их мембраны продуктов ПОЛ, образование которых существенно увеличивается под влиянием исследуемых ксенобиотиков [2,3,12,13]. Известно, что накопление кальция митохондриями является энергозависимым активным процессом, протекающим против градиента концентрации ионов. Поскольку накопление кальция митохондриями идет за счет энергии транспорта электронов в дыхательной цепи, то в этом случае, возможно, вся энергия дыхания будет тратиться главным образом на транспорт кальция, а не на фосфорилирование АДФ, то есть разобщаются процессы дыхания и фосфорилирования [1,8]. Вторым важным фактором, влияющим на процессы образования макроэргических соединений в митохондриях при токсификации гепатоцитов, может быть накопление свободных жирных кислот, которые, как известно, в больших количествах вызывают разобщение процессов окисления и фосфорилирования. Источником образования значительного количества свободных жирных кислот при этом могут быть процессы, которые связаны с нарушением структурно-метаболической организации мембранных структур, в том числе и мембран митохондрий [6].

Выводы.

1. В результате оценки метаболического состояния митохондрий гепатоцитов животных, подвергавшихся длительному воздействию субтоксических доз 1/10 и 1/100 LD50 лапроксидов Л-303 и Л-500, выявлено резкое снижение энергопродукции, разобщение процессов дыхания и окислительного фосфорилирования, что может быть обусловлено развитием мембранной патологии.

2. Установлено, что под влиянием данных ксенобиотиков в дозах 1/10 и 1/100 LD50 значительно снижается дыхание митохондрий (скорость потребления кислорода) после добавления субстрата окисления - сукцината, ослабляется дыхание после добавления АДФ, а также после добавления разобщителя окисления и фосфорилирования – 2,4 – ДНФ по сравнению с контролем.

3. На этом фоне наблюдалось снижение величины дыхательного коэффициента Ларди, коэффициента фосфорилирования, ослабление активности ферментов Ca²⁺-, Mg²⁺- и Н⁺-АТФ-аз. Лапроксиды, оказывая ингибирующее влияние на активность Ca²⁺-, Mg²⁺-зависимой АТФ-азы, обеспечивают накопление Ca²⁺ в митохондриях и снижают их фосфорилирующую способность.

4. Отсутствие статистических различий полученных результатов с показателями контроля при дозе 1/1000 LD50 исследуемых лапроксидов позволяет считать данную дозу недействующей на метаболическое состояние митохондрий гепатоцитов.

Перспективы дальнейших исследований. Полученные результаты могут быть основой для дальнейшего изучения влияния субтоксических доз лапроксидов на метаболический статус теплокровных животных в условиях подострого опыта.

Таблица

Влияние субтоксических доз лапроксидов Л-303 и Л-500 на метаболическое состояние митохондрий гепатоцитов крыс в подостром опыте

Показатели	Группа наблюдения, доза LD50, М±m
	Марка лапроксида	Контроль (n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
Дыхание митохондрий после добавления сукцината (V4), (нмоль О2/мин•мг белка)	Л-303	1,82±0,16	1,15±0,12*	1,38±0,18*	1,76±0,14
	Л-500	1,82±0,16	0,95±0,08*	1,26±0,17*	1,71±0,19
Дыхание после добавления АДФ (V3), (нмоль О2/мин•мг белка)	Л-303	6,3±0,54	2,74±0,23*	3,56±0,28*	6,2±0,43
	Л-500	6,3±0,54	2,54±0,32*	3,49±0,28*	6,15±0,66
Дыхание после добавления разобщителя 2,4-ДНФ (V4'), (нмоль О2/мин•мг белка)	Л-303	7,46±0,63	3,52±0,28*	4,35±0,46*	7,38±0,56
	Л-500	7,46±0,63	3,40±0,34*	4,35±0,48*	7,24±0,58
Дыхательный коэффициент Ларди (ДК=V3/V4, отн.ед)	Л-303	3,46±0,35	2,38±0,17*	2,58±0,31*	3,52±0,27
	Л-500	3,46±0,35	2,67±0,20*	2,77±0,22*	3,59±0,41
Коэффициент фосфорилирования (АДФ/О2)	Л-303	2,64±0,27	1,16±0,13*	1,82±0,17*	2,73±0,31
	Л-500	2,64±0,27	1,20±0,09*	1,75±0,14*	2,58±0,32
Mg^2+- АТФ-аза (мкмоль Р/мг белка•1 час)	Л-303	81,46±4,7	42,58±3,7*	54,6±3,8*	82,53±5,26
	Л-500	81,46±4,70	45,3±3,44*	56,23±4,52	79,6±4,82
Ca^2+- АТФ-аза (мкмоль Р/мг белка•1 час)	Л-303	73,52±5,10	39,65±3,20*	43,7±4,10*	74,37±4,93
	Л-500	73,52±5,10	38,93±3,56*	48,6±3,74	71,96±5,43
Н^+- АТФ-аза (мкмоль Р/мг белка•1 час)	Л-303	74,60±4,35	37,80±4,35*	52,63±5,27*	73,50±5,80
	Л-500	74,60±4,35	44,7±3,68*	62,3±5,82*	72,36±6,40

Примечание: * ─ различия с контролем достоверные, р ≤ 0,05.

Список литературы

1. Денисов В.М. Биохимия миокарда, поврежденного адреналином / В.М. Денисов, С.М. Рукавишникова, В.И. Жуков – Харьков: РИП „Оригинал”, 1999. – 184 с.

2. Жуков В.И. Фториды: биологическая роль и механизмы действия / В.И. Жуков, О.В. Зайцева, В.И. Пивень [и др.]. − Белгород: Белвитамины, 2006. − 220 с.

3. Жуков В.И. Простые и макроциклические эфиры: научные основы охраны водных объектов / В.И. Жуков, Л.Д. Попова, О.В. Зайцева [и др.]. − Харьков: «Торнадо», 2006. − 438 с.

4. Кожем’якін Ю.М. Науково-практичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними / Ю.М. Кожем’якін, О.С. Хромов, М.А. Філаненко [та ін.]. − Київ: Авіценна, 2002. − 156 с.

5. Кундиев Ю.И. Химическая опасность в Украине и меры по ее предупреждению / Ю.И. Кундиев, И.М. Трахтенберг // Журнал АМН України. − 2004. − Т.10, № 2. − С 259-267.

6. Марченко М.М. Біохімічна біотрансформація ксенобіотиків у організмі / М.М. Марченко, О.В. Кеца, М.М. Великий. – Чернівці: Чернівецький нац. ун-т, 2011. – 280 с.

7. Меншиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меншиков. – Москва: Медицина. – 1987. – 368 с.

8. Мешкова Н.П. Практикум по биохимии / Н.П. Мешкова, С.Е. Северин. – М.: МГУ, 1979. – 428 с.

9. Пирузян Л.А. Прогностический фактор риска развития патологических процессов, основанный на полиморфизме ферментов метаболизма ксенобиотиков / Л.А. Пирузян, В.А. Суханов, В.А. Саприн // Физиология человека. – 2000. – Т. 26, № 2. – С. 115-123.

10. Романов В.И. Выбросы вредных веществ и их опасности для живых организмов / В.И. Романов, Р.Л. Романова. – Москва: Физматкнига, 2009. – 376 с.

11. Тимченко О.І. Методологія оцінки впливу чинників довкілля на здоров’я населення: вибір типу досліджень і показників / О.І. Тимченко, А.М. Сердюк, О.І. Турос, Є. М. Омельченко // Журнал АМН України. – 2000. – Т.6, № 3. – С. 566-574.

12. Цыганенко А.Я. Научные основы обоснования прогноза потенциальной опасности детергентов в связи с регламентацией в воде водоемов / А.Я. Цыганенко, В.И. Жуков, Н.Г. Щербань [и др.]. – Белгород: Белвитамины, 2001. – 422 с.

13. Щербань Н.Г. Биохимические механизмы радиомиметических эффектов поверхностно-активных веществ / Н.Г. Щербань, В.И. Жуков, В.В. Мясоедов, В.А. Капустник. – Харьков: «Раритеты Украины», 2012. – 120 с.

14. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purpose: Council of Europe 18.03.1986. – Strasbourg. – 1986. – № 123. – 52 p.

Сведения об авторах

1. Кучерявченко Марина Александровна

Харьковский национальный медицинский университет, г. Харьков, Украина

Кандидат медицинских наук

Доцент кафедры патофизиологии

2. Зайцева Ольга Васильевна

Харьковский национальный медицинский университет, г. Харьков, Украина

Доктор биологических наук

Профессор кафедры медицинской и биологической физики и медицинской информатики

3. Жуков Виктор Иванович

Харьковский национальный медицинский университет, г. Харьков, Украина

Доктор медицинских наук; доктор биологических наук

Заведующий кафедрой биологической химии

4. Книгавко Владимир Гиляриевич

Харьковский национальный медицинский университет, г. Харьков, Украина

Профессор, доктор биологических наук

Заведующий кафедрой медицинской и биологической физики и медицинской информатики

Почтовый адрес для переписки:

Украина, г.Харьков, 61002, ул. Ахсарова, д. 20-А, кв. 136

Зайцевой Ольге Васильевне

Контактный телефон:

(+38) – 067-375-20-28 – моб.

(057) – 707-73-67 – раб.

(057) – 707-73-35 – раб.

e-mail: olg_vas48@mail.ru

e-mail: balyk_irina@mail.ru