Биологические науки/9.Биохимия и биофизика

Рымко А.Н., Саунин А.В.*, Коровашкина А.С.,

Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

*Международный государственный экологический университет

им. А.Д. Сахарова, Минск

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ СЛОИСТОГО ДВОЙНОГО ГИДРОКСИДА ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ПЛАЗМИД, ОБОГАЩЕННЫХ CpG-МОТИВАМИ

Как известно, бактериальная ДНК (наряду с другими бактериальными патоген-ассоциированными молекулярными структурами), способна активировать разделы врожденного и адаптивного иммунитета человека и животных. Эта активность обусловлена присутствием в молекуле бактериальной ДНК неметилированных CpG-динуклеотидов. Особые участки ДНК, содержащие такие динуклеотиды (CpG-мотивы), распознаются одним из классов Toll-подобных рецепторов (TLR9) на иммунокомпетентных клетках и инициируют каскад сигнальных реакций, который приводит к активации механизмов сначала врожденной, а затем и адаптивной ветвей иммунитета [1].

Созданные с применением генно-инженерной техники препараты плазмидной ДНК (пДНК), обогащенной CpG-мотивами (CpG-пДНК), являются перспективными средствами для лечения многих заболеваний, но ввиду низкой стабильности пДНК в русле крови, необходима разработка эффективных способов её доставки в клетки-мишени.

Среди кандидатов в переносчики пДНК рассматриваются неорганические слоистые двойные гидроксиды (СДГ), из-за своей низкой токсичности, высокой емкости и повышенной способности проникать в клетки [2].

По химической природе СДГ – класс анионных глин. Их структуру описывают в виде металл-гидроксидных слоев, в которых часть дивалентных катионов изоморфно замещена на катионы тривалентные, что приводит к возникновению на слоях положительных зарядов. Эти заряды компенсируются за счет интеркаляции гидратированных анионов в межслойное (галерейное) пространство [3].

Целью настоящей работы явилось изучение возможности получения комплекса СДГ с CpG-пДНК.

Материалы и методы. CpG-пДНК получали, как описано нами ранее [4].

Нитратную форму СДГ (MgAl/NO₃-СДГ) синтезировали методом, описанным в работе [5].

Для синтеза комплекса СДГ с CpG-пДНК ионообменной реакцией к 600 мкл полученной выше суспензии MgAl/NO₃-СДГ добавляли 5 мкг CpG-пДНК, реакцию проводили в течение 1 сут, при умеренном перемешивании, без доступа воздуха и нормальных условиях.

Для синтеза комплекса СДГ с CpG-пДНК методом соосаждения к 300 мкл 0,05 М раствора NH₄OH, содержащего 5 мкг CpG-пДНК, покапельно и при постоянном интенсивном перемешивании добавляли 300 мкл раствора, содержащего 0,02 М MgCl₂ и 0,01 М Al(NO₃)₃. Дальнейшая процедура полностью повторяла описанную выше процедуру синтеза нитратной формы СДГ. Эффективность интеркаляции ДНК в состав СДГ оценивали спектрофотометрически.

Для элюции плазмиды из комплекса с СДГ к его суспензии прибавляли 0,1 М калий-фосфатный буфер (КФБ) со значениями pH 3,0 и 7,0. За ходом элюции следили на протяжении 1 ч. Степень элюции CpG-пДНК определяли по значению оптической плотности супернатанта (λ=260 нм).

Приведенные в работе экспериментальные данные представляют собой доверительные интервалы среднего арифметического для 95%-ного уровня вероятности.

Результаты и обсуждение. В настоящее время комплексы биомолекул с СДГ получают, как правило, двумя методами: соосаждением [6] и ионным обменом [7].

Как видно из таблицы 1, связывающая способность СДГ в отношении ДНК сильно зависит от метода получения комплекса.

Таблица 1

Иммобилизационные свойства СДГ по отношению к ДНК при разных способах получения комплексов СДГ-ДНК

Метод иммобилизации ДНК	Эффективность связывания ДНК, мкг ДНК/мг СДГ
Соосаждение	830±90
Ионный обмен	490±40

Так, при использовании метода соосаждения, емкость СДГ по отношению к ДНК в 1,7 раза больше, чем при использовании метода ионного обмена.

Следующим этапом исследования было изучение динамики элюции CpG-пДНК из комплекса с СДГ при различных значениях рН. Как видно из рисунка 1, освобождение пДНК из комплекса с СДГ при нейтральном значении рН не отличается от скорости освобождения при кислых значениях рН.

Рисунок 1. Динамика элюции CpG-пДНК из комплекса с СДГ в 0,1 М КФБ при различных значениях рН

Элюция CpG-пДНК из комплекса с СДГ, предположительно, обязана не разрушению СДГ (что свойственно комплексам, содержащим низкомолекулярные соединения), а протеканию ионообменной реакции с замещением пДНК на неорганический фосфат, присутствующий в буфере. Следует отметить, что визуально не наблюдалось растворения белого осадка комплекса СДГ с CpG-пДНК при рН равным 3,0, что еще раз подтверждает предположение о преимущественном ионообменном механизме элюции ДНК из комплекса.

Такое атипичное поведение комплекса при низких значениях рН, скорее всего, объясняется природой иммобилизованной молекулы ‒ высокополимерной ДНК.

Элюция ДНК из комплекса СДГ с CpG-пДНК также зависит и от объёма элюирующего буфера. Так, при увеличении объема 0,1 М КФБ, увеличивается и степень элюции CpG-пДНК. Данная зависимость отражена на рисунке 2.

Рисунок 2. Зависимость элюции CpG-пДНК из комплекса с СДГ от объема 0,1 М КФБ (рН 7,0)

Таким образом, в ходе проделанных экспериментов были впервые получены устойчивые комплексы СДГ с CpG-пДНК различными методами. Показано преимущество метода соосаждения для иммобилизации CpG-пДНК на СДГ. Отражена динамика элюции CpG-пДНК из комплексов с СДГ в буферный раствор при различных значениях рН. Продемонстрирована зависимость элюции CpG-пДНК из комплекса с СДГ от объема элюента.

Литература:

1. Krieg, A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects / A.M. Krieg // Annu. Rev. Immunol. ‒ 2002. ‒ Vol. 20. ‒ P. 709‒760.

2. Choi, S.J. Anticancer drug-layered hydroxide nanohybrids as potent cancer chemotherapy agents / S.J. Choi, J.M. Oh, J.H. Choy // J. Phys. Chem. Solids. ‒2008. ‒Vol. 69, № 5-6. ‒P. 1528–1532.

3. Sugar–anionic clay composite materials: intercalation of pentoses in layered double hydroxide / S. Aisawa [et al.] // J. Solid State Chem. ‒ 2003. ‒ Vol. 174, № 2. ‒ P. 342–348.

4. Коровашкина, А.С. Создание штамма Escherichia coli ‒ продуцента плазмидной ДНК, обогащенной иммунотропными СрG-мотивами / А.С. Коровашкина, С.В. Квач, А.И. Зинченко // Стремления ‒ 2011: сб. материалов II Междунар. научн.-практ. конф. мол. ученых, Минск, 14-18 ноября 2011 г. Минск, Беларуская наука, 2011. ‒Т.1. ‒ С. 184‒187.

5. Иммобилизация диаденозинтетрафосфата включением в слоистый двойной гидроксид / Д.В. Бурко [и др.] // Wschodnia spolka–2009: materialy V Miedzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji, Przemysl, 07–15 wrzesnia 2009. – V. 6. – S. 28–32.

6. Comparison of different synthesis routes for Mg–Al layered double hydroxides: Characterization of the structural phases and anion exchange properties / H.W. Olfs [et al.] // Appl. Clay Sci. ‒ 2009. ‒ Vol. 43, № 3–4. ‒ P. 459–464.

7. Intercalation of nucleotides into layered double hydroxides by ion-exchange reaction / S. Aisawa [et al.] // Appl. Clay Sci. ‒ 2005. ‒ Vol. 28, № 1-4. ‒ P. 137–145.