Бугера А.Ю.

Національний університет харчових технологій, м. Київ, Україна

Дослідження тривалої збудливої дії IGF-1 на загоєння ран у мишей під час цукрового діабету

Цукровий діабет – хвороба, у якої одним з багатьох небезпечних симптомів є хронічне незагоєння ран у хворих. Цукровий діабет погіршує процес загоєння ран, а також гальмує процеси запалення, реепітелізації, матриці осадження, ангіогенезу. Загоєння ран являє собою складний процес і включає в себе кілька етапів (основні - запалення, проліферація і дозрівання) та участь багатьох підтипу клітин (тромбоцитів, нейтрофілів, макрофагів, кератиноцитів, фібробласти, ендотеліальні клітини, нервові клітини, лімфоцити та ін). Один з гормонів, які, впливає на процес відновлення, є гормон росту (GH). Багато функцій гормону росту здійснюється через інсуліноподібний фактор росту типу І (IGF-1). IGF-1 включає декілька внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, які мають величезне значення для росту, диференціації та подальшого розвитку клітин. Запальна реакція є необхідною умовою для початку репарації рани, яка в свою чергу вимагає збільшеного вмісту IGF-1 в місці пошкодження. Рівень IGF-1 зменшується в незагоєних ранах шкіри діабетичної особи.

Метою дослідження є вивчення особливостей впливу експресії трансгенного mIGF-1 на швидкість загоєння ран.

Матеріали та методи.

Експерименти були проведені на мишах-самцях лінії FVB з трансгеном K14/mIGF-1 (tg) та без нього (wt), віком 3-4 міс. Тварини утримувалися на базі віварію ДУ “Інститут геронтології ім. Д.Ф. Чеботарьова НАМН”. В дослідження використовувалися миші з гетерозиготним генотипом. Наявність чи відсутність трансгенного IGF-1 визначалася генотипуванням при народженні, пропис праймерів наведено у табл. 1. Миші були надані Европейскою молекулярно біологічною організацією (ЕМБЛ) і утримувалися на базі віварію Інституту геронтології.

Таблиця 1.

Найменування гена	Послідовність
GAPDH	F	GGT GAA GGT CGG TGT GAA CGG A
GAPDH	R	TGT TAG TGG GGT CTC GCT CCT G
IGF-1 (tg)	F	TAC CAG CTC GGC CAC AGC C
IGF-1 (tg)	R	CCG GAT GGA ACG AGC TGA C
IGF-1 (total)	F	TGC TCT TCA GTT CGT GTG

Досліди проводили на моделі стрептозотоцин-індукованого діабету. В дослідження взято 4 групи: дикі тварини – wt; дикі тварини з діабетом – wtD; трансгенні тварини з діабетом – tgD. Тваринам внутрішньобрюшинно ввводився стрептозотоцин (Sigma, 50 мг / кг) протягом 5 діб поспіль. Для експерименту були взяті тварин з рівнем глюкози > 15 ммоль / л

Результати та обговорення.

Експресія IGF-1 під час загоєння ран у мишей з діабетом.

В експериментах ми використовували трансгенних мишей, яким було перенесено ген щурячого mIGF-1 щурів, який вбудовано під контроль людського промотора K14. Semenova E. et al. показали, що експресія трансгенного фрагменту була виявлена в шкірі, але не в печінці або серці K14mtg мишей [16]. Гібридизація in situ підтвердила експресію mIGF-1 трансгенів у K14-позитивних клітинах базального шару епідермісу та в зовнішній оболонці кореня і опуклій частині волосяних фолікулів [16]. У наших експериментах для визначення загальної експресії гена IGF-1 ми використовували праймери як для tg IGF-1, так і для продукції власного IGF-1 (рис. 1). Ми виявили, що загальний рівень експресії IGF-1 рівня експресії гена тенденцію до зниження в неушкодженій шкірі мишей дикого типу з діабетом і має тенденцію до збільшення у діабетичних трансгенних мишей порівняно з інтактними тваринами (0 доба). На 5 і 8 добу після травми експресія гену IGF-1 був значно вищою в шкірі діабетичних мишей дикого типу порівняно з 0 добою. У трансгенних тварин, рівень експресії IGF-1 був значно вище в шкірі і гранульомній тканині на 5 і 8 добу після травми, порівняно з інтактними мишами дикого типу (рис. 1А, В), а також в гранульомній тканині на 8 добу, порівняно з діабетичними тваринами дикого типу (рис. 1В).

*

#

#

#

@

@

#

#

Рисунок. 1. Рівень експресії IGF-1 в шкірі (А) та гранульомній тканині (Б) дослідних тварин. інший строк загоєння ран (середнє ± SE; * – Р (t) <0,05 порівняно з тою ж тканиною в групі диких тварин з діабетом; @ – P (U) <0,05 порівняно з неушкодженою шкірою тої ж групи; – P (U) <0,05 порівняно з тою ж тканиною у групі диких тварин. Відносні одиниці.

Таким чином, ми виявили, що експресія гену IGF-1 в пошкодженій шкірі значно збільшується порівняно з непошкодженою тканиною на 5 і 8 добу у мишей з діабетом. У групі трансгенних тварин з діабетом це збільшення було тільки як тенденція, але рівні мРНК IGF-1 в шкірі тварин цієї групи були значно вищі порівняно з диким типом. На 5 добу в гранульомній тканині обох груп з діабетом експресія IGF-1 була збільшена, на 8 добу підвищений рівень мРНК зберігався лише в групі трансгенних мишей, і ми вважаємо, що максимальний ефект від трансгену може бути протягом всього періоду загоєння.

Література

1. Shkumat M.S.,Leonov Y.V., Pishel I.M. Prolonged inflammatory cytokine expression during the late phase of wound healing in the diabetic K14/mIGF1 transgenic mice.

2. Semenova E., Koegel H., Hasse S., Klatte J., Bilbao D., Werner S., Rosenthal N. Overexpression of mIGF-1 in Keratinocytes Improves Wound Healingand Accelerates Hair Follicle Formationand Cycling in Mice// The American Journal of Pathology November – 2008. – Vol.173, №.5.

3. Yang H., Wright J.R. Human beta-cells are exceedingly resistant to streptozotocin in vivo // Endocrinology. – 2002. – Vol. 143, № 7. – P.2491-2495.