М.А. Джакашева¹, Б.Ш. Кедельбаев¹, П. Либерцайт²

¹Южно-Казахстанский государственный университет им. М.Ауезова,

²University of Vienna, Austria

Выделение и очистка пектолитических ферментов с помощью гидроксиапатита

Пектиназы – представляют собой гетерогенную группу ферментов, катализирующих деградацию пектина. Одним из основных источников получения пектолитических ферментов (ПФ) являются микроскопические грибы, которые обладают характерной особенностью синтезировать широкий спектр активных внеклеточных пектиназ [1-2]. Культуральные жидкости (КЖ), полученные после ферментации микроорганизмов – продуцентов ПФ, содержат значительное количество нерастворимых примесей в виде субстратов, ионов металлов, которые могут оказывать активирующее или ингибирующее действие. Существует множество способов выделения и очистки ферментов из КЖ и растворов технических ферментных препаратов (ФП), сущностью которых является разделение многокомпонентных смесей органических веществ и минеральных солей для удаления основной массы неактивных белков и примесей небелковой природы. Наличие в ФП примесей углеводов и пектиновых веществ может существенным образом исказить результаты анализа состава продуктов ферментолиза пектиновых полисахаридов и затруднить выделение физиологически активных фрагментов [3]. Поэтому разработка способов получения очищенных и активных пектолитических ферментов является весьма актуальной.

Одним из эффективных способов выделения и очистки ПФ является метод адсорбции с помощью такого неорганического сорбента, как гидроксиапатит, который является кристаллической формой фосфата кальция. Данный способ позволяет комплексные ФП, содержащие смесь изоферментов с разными температурными и рН оптимумом действия, механизмом действия и субстратной специфичностью [4].

Для комплексного выделения ПФ из КЖ, полученной в результате культивирования штамма A. awamori F-RKM 0719, использовали наноразмерный Si- гидроксиапатит, который был синтезирован методом осаждения из растворов, описанным в работе [5]. В качестве реагентов были использованы насыщенный раствор гидроксида кальция, раствор ортофосфорной кислоты. В качестве реагента - «поставщика» аниона SiO₄ ^4– использовали тетраэтоксисилан. Наноразмерный Si- гидроксиапатит вводили в концентрации 30 г/л в течение 30 мин при 4^оС и разных значения рН ферментного раствора, указанных в таблице.

Таблица - Влияние рН среды на эффективность адсорбции пектиназ наноразмерным Si- гидроксиапатитом

рН среды ферментного раствора	ПкС, %	ПгС, %	Степень очистки по цветности,%	Удельная активность, ед/мг белка
3	76	45	72	135,7
4	82	51	74	170,0
5	89	56	83	322,0
6	95	69	92	425,5
7	80	49	97	368,4

Как видно из данных таблицы, наиболее оптимальным значением рН раствора, при котором осуществляется наибольшая удельная активность (425,5%), является значение, равное 6. Это объясняется тем, что при значениях рН 6, пектиназы заряжаются отрицательно, а ионы кальция – положительно, и за счет взаимодействия отрицательно заряженных карбоксильных групп пектиназ осуществляется сорбция с положительно заряженными ионами кальция. Кроме того, за счет удаления из растворов ионов металлов, происходит активация ферментов, при котором осуществляется максимальный выход активности пектиназ, равный 95,0%, полигалактуроназ – 69,0% и степень очистки по цветности составляет 92,0%.

Таким образом, за счет адсорбционной очистки ферментных растворов удалось не только достичь высокой степени очистки, но и активировать ПФ за счет удаления из растворов ионов металлов. Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности применения наноразмерного Si- гидроксиапатита для очистки пектолитических ферментов, полученных при культивировании штамма A. awamori F-RKM 0719.

Литература

1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. Москва: Издательство «Элевар», 2000. 512с.

2. Sunnotel O., Nigam P. Pectinolytic activity of bacteria isolated from soil and two fungal strains during submerged fermentation // World Journal of microbiology and Biotechnology. - 2002.- №18. - P. 835-839.

3. Донцов А.Г., Шубаков А.А. Пектинолитические ферменты: очистка, активация, микробиологический синтез. Екатеринбург: Изд-во УрО РАН, 2010. - C. 82-90.

4. Донцов А.Г., Шубаков А.А. Активация полигалактуроназ в процессе очистки: эффект использования кальцийсодержащих носителей // Естеств. и техн. науки. – 2009. №6. С. 196-198.

5. Ле Ван Тхуан, Доан Ван Дат, Г. Е. Темирханова. Синтез и исследование морфологии кремний - замещенного наноразмерного гидроксиапатита // Научная инициатива иностранных студентов и аспирантов российских вузов: Сборник докладов IV Всероссийской научно -практической конференции . Томск , 24–26 мая 2011 года . Томск: Издательство ТПУ, 2011. с. 346–349.