Меньшикова Н.С., Агаркова Т.А., Евтушенко И.Д., Новицкий В.В., Наследникова И.О., Ткачёв В.Н., Кублинский К.С.

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российский Федерации»

Полиморфный вариант гена IL12B, как иммуногенетический маркер генитального эндометриоза

Введение. Несмотря на более чем столетний период, прошедший с момента описания эндометриоза, проблема его изучения не только не утратила своей актуальности, но, напротив, остается эпицентром дискуссий. Эндометриоз – генетически детерминированное, хроническое, дисгормональное, иммунозависимое заболевание с доброкачественным разрастанием ткани, идентичной по морфологическому строению и функции эндометрию за пределами слизистой оболочки матки. Истинную частоту генитального эндометриоза оценить практически невозможно, поскольку вопрос верификации диагноза, за исключением гистологического анализа послеоперационного или секционного материала, остается открытым.

В патогенезе генитального эндометриоза важная роль принадлежит нарушениям иммунного гомеостаза: большое внимание уделяется изучению роли цитокинов в механизмах формирования эндометриоидных очагов. Гены цитокинов характеризуются наличием одного или нескольких структурных полиморфизмов, которые не приводят к значимым изменениям первичной структуры белка, и соответственно, очевидным патологическим последствиям, однако оказывают влияние на функциональную активность или уровень экспрессии кодируемых белков.

Цель исследования: на основании анализа распределения аллельных вариантов и генотипов полиморфизма A1188C гена IL12В идентифицировать маркеры подверженности генитальному эндометриозу.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В программу исследования были включены 240 пациенток репродуктивного возраста от 19 до 43 лет (средний возраст 30,6±1,2 года), которые были госпитализированы в гинекологическую клинику ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России в 2009-2012 гг. для выполнения лечебно-диагностической и оперативной лапароскопии и гистероскопии. Лапароскопию и гистероскопию выполняли по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «KarlStorz» (Германия).

Основную группу составили 140 женщин с генитальным эндометриозом. Диагноз эндометриоза был поставлен в результате осмотра брюшины и органов малого таза на наличие эндометриоидных очагов в ходе эндоскопических методов исследования, с последующим гистологическим подтверждением. При поступлении в клинику пациентки предъявляли жалобы на бесплодие (средняя продолжительность 3,6±1,1 лет), которое у 98 пациенток было первичным, а у 42 женщины – вторичным. Кроме того, 68% пациенток данной группы предъявляли жалобы на болевой синдром, 74% – на дисменорею, 38% – на диспареунию, 36% – на нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии. Наиболее часто, в 85% случаев, во время лапароскопии диагностировались малые формы эндометриоза, в то время как эндометриоидные кисты – в 64%, из них двусторонние в 30% случаев. Частота ретроцервикального эндометриоза не превышала 13%.

В группу сравнения вошли 100 женщин, у которых при проведении эндоскопического исследования был исключен генитальный эндометриоз. Показанием для вмешательства было бесплодие. Объем оперативного вмешательства для всех пациенток данной группы был одинаков и представлен диагностической лапароскопией и гистероскопией.

У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор и использование крови для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром в день операции. Стабилизированные образцы крови хранили при –70°С до момента исследования. Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Исследование полиморфного участка A1188C гена IL12В, локализованного в промоторном участке, проводили с использованием аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе при использовании амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). После проведения ПЦР 8 мкл амплификата разделяли в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, при напряжении 150 B в течение нескольких мин для последующей визуализации в ультрафиолетовом свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим», Россия).

Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах женщин, используя критерий χ² с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации разных генотипов и аллелей с заболеванием судили по величине отношения шансов (odds ratio (OR)) с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Проведенное нами иммуногенетическое исследование показало, что среди женщин без генитального эндометриоза преобладающим оказался генотип АС полиморфного участка A1188C гена IL12В, выявленный у 45% обследованных. Генотип АА полиморфного региона A1188C гена IL12В был выявлен у 35%, а генотип СС – у 20% женщин. У пациенток с генитальным эндометриозом генотип АА полиморфизма A1188C гена IL12В встречался у 45% обследованных, генотип АС – у 45%, а генотип СС – у 10% обследованных.

Статистически значимое снижение частоты встречаемости аллеля С (χ² =1,32; р=0,05) и генотипа СС (χ² =2,93; р=0,01) полиморфного региона A1188C гена IL12В среди пациенток с генитальным эндометриозом указывало на протективный эффект в отношении предрасположенности к заболеванию (соответственно OR=0,61 и OR=0,50). Подверженность эндометриозу была положительно ассоциирована с генотипом АА (OR=2,49) промоторного региона A1188C гена IL12В.

Имеются сведения о том, что аллель С полиморфного варианта А1188С гена IL12В, расположенный в 3'-нетранслируемой области понижает экспрессию гена IL12В, в то время как аллель А ассоциирован с повышением экспрессии гена IL12В in vitro, однако сведения о функциональном эффекте этого полиморфизма весьма противоречивы. В частности, при исследовании гена IL12В при вирусном гепатите была отмечена хронизация воспалительного процесса у пациентов, являющихся носителями генотипа АА полиморфного варианта А1188С гена IL12В, что, по мнению авторов, ассоциировано с более низкой продукцией IL-12β.

Таким образом, приведенные нами данные свидетельствуют о предрасположенности женщин с конкретными аллельными вариантами и генотипами гена IL12В к эндометриозу.

ВЫВОДЫ:

1. У пациенток с генитальным эндометриозом преобладают аллель А и генотипа АА полиморфного участка A1188C гена IL12В.

2. Подверженность генитальному эндометриозу положительно ассоциирована с генотипом АА полиморфизма A1188C гена IL12В.

3. Иммуногенетическими факторами, обладающими протективным эффектом в отношении предрасположенности к эндометриозу, являются аллель аллель С и генотип СС полиморфизма A1188C гена IL12В.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Рухляда Н.Н. Диагностика и лечение манифестного аденомиоза. СПб: Элби-СПб; 2004; 245 с.

2. Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы. Медицина; 2006; 411 с.

3. Ищенко А.И. Патогенез, клиника, диагностика и оперативное лечение распространенных форм генитального эндометриоза. Автореф. дис. докт. мед. наук. М; 1993.

4. Ищенко А.И., Кудрина Е.А. Эндометриоз: диагностика и лечение. М: ГЭОТАР-МЕД; 2002; 104 с.

5. Махмудова Г.М., Попов А.В. Роль некоторых факторов перитонеальной жидкости в патогенезе эндометриоза. Российский вестник акушства и гинекологии 2004; 2: 27—30.

6. Ищенко А.И., Кудрина Е.А. Эндометриоз: современные аспекты патогенеза, диагностики и лечения. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии 2003; 2: 68—75.

7. Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы. – М.:Медицина, 2006. – 416с.

8. Айламазян Э.К., Потин В.В., Тарасова М.А. и др. Генитальный эндометриоз // Гинекология от пубертата до постменопаузы. – М.: МЕДпресс-информ, 2007.- С.284-302.

9. Дамиров М.М. Генитальный эндометриоз – болезнь активных и деловых женщин. Москва, Бином-Пресс, 2010. – 192с.

10. Ищенко А.И., Кудрина Е.А. Эндометриоз: диагностика и лечение. – М.:МИА, 2008. – 176с.

11. Козлов В.А., Сенников С.В.. Система цитокинов: Теоретические и клинические аспекты // – Новосибирск: Наука, 2004. – 324 с.

12. Симбирцев А.С., Громова А.Ю.. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления // Иммунология. – 2005. – №1. – С.67.

13. Allaire C. Endometriosis and infertility: a review // J. Reprod. Med. – 2006. – V.51.№3. – Р. 164-168.

14. Harada T., Iwabe T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis // Fertil. Steril. – 2001. – V.76.№1. – Р. 1-10.

15. Iwabe T., Harada T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis-associated infertility // Gynec. Obstet. Invest. – 2002. – V.53.№1. – Р. 19-25.

16. Koninckx P.R., Kennedy S.H., Barlow D.H. Pathogenesis of endometriosis: the role of peritoneal fluid // Gynecol. Obstet. Investing. 1999. Vol. 47. N1. – P.23-33.