УДК: 577.1; 577.2; 577.15; 577.2.04

Кульбаева Г.А., Ригер Н.Г*., Ибрагимова С.А*., Карабалин А.Б*., Кастер*

Сартаев А.С.

Биологические науки/9.Биохимия и биофизика

Магистрант Кульбаева Г.А.

Казахский Государственный Женский Педагогический Университет

*«Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина»,

Казахстан 050012 Досмухамедова 86. gulzat.kul@mail.ru

ДИАГНОСТИКУМ НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА МДГ – ГОАТ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГЕНОТИПОВ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССОВЫМ ФАКТОРАМ

Введение

Известно, что абиогенные и биогенные стрессовые факторы сильно уменьшают продуктивность злаковых культур. Поэтому одной из важных и актуальных задач, стоящих перед наукой, является разработка надежных ферментных диагностикумов для селекции злаковых культур на устойчивость к стрессовым факторам. Это позволит успешно и быстро выводить устойчивые к различным стрессовым факторам новые сорта злаковых культур.

Одним из наиболее сильных токсических агентов возникающих при стрессе является аммиак [1]. Аммиак оказывает повреждающее действие на биомембраны. Основная часть аммиака выделяется при действии глютаматдегидрогеназы на глютаминовую кислоту. В этом плане особое внимание следует обратить на растения, относящиеся к семейству злаковые.

Важнейшей особенностью злаковых культур является то, что они имеют сильно выраженный обмен глютаминовой кислоты. Наличие большого количество глютамата в этих растениях при стрессе приводит к большому накоплению аммиака, что губительно действует на растения.

Таким образом, задача селекционеров состоит в том, чтобы вывести такие генотипы злаковых культур, которые бы меньше накапливали аммиак при стрессе. Ключом к созданию таких генотипов явилось следующее. Так, в лаборатории структуры и регуляции ферментов Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина был открыт новый путь расщепления глютамата без выделения токсического аммиака. Этот путь осуществляет ранее неизвестный ферментный комплекс (ФК), состоящий из малатдегидрогеназы (МДГ) и глютаматоксалоацетат аминотрансферазы (ГОАТ) [2]. В ходе реакции с участием ферментного комплекса аминогруппа глютаминовой кислоты переходит в аминогруппу, синтезируемой при этом аспарагиновой кислоты. Таким образом, ферментный комплекс осуществляет расщепление глютамата без выделения свободного аммиака. Можно предположить, что генотипы с высоким уровнем активности ФК будут накапливать мало аммиака при действии стрессовых факторов и тем самым они будут лучше адаптированы к действию стресса. То есть активность ФК может служить диагностикумом устойчивости злаковых культур к стрессовым факторам. Наше предположение о связи активности ФК с устойчивостью злаковых культур экспериментально доказывается в этой статье.

Материалы и методы

Среди сельскохозяйственных растений наиболее важными культурами в Казахстане являются пшеница и ячмень. Поэтому основными объектами исследования явились различные генотипы пшеницы (Triticum aestivum L.) - сорта «Attila», «Саратовская-29», «Дауыл», «Толкын», «Арай», «Казахстанская-10», а также ячменя (Hordeum L.) - сорта «Унумли-арпа», «Сауле», «Иран-4470», «Би-10», «Бота», «Арна», различающиеся между собой по устойчивости к ржавчинным болезням и по солеустойчивости.

Сорта злаковых растений были получены из коллекции ТОО «КазАгроинновации» МСХ РК «Казахского института земледелия и растениеводства», п. Алмалыбак, Карасайского района, Алматинской области, и из коллекции института проблем биобезопасности пос. Гвардейский, Жамбылской области.

В работе использовался спектрофотометрический метод определения активности ФК МДГ-ГОАТ. Реакционная смесь для определения ФК содержала 1,1 мМ NAD, 12 мМ малата и 87 мМ глютамата натрия, реакционная смесь доводилась до объема 2 мл 0,05 М трис-глициновым буфером, рН 7,7 [3]. Процедура определения активности ФК имеет свои особенности. Сначала мы в течение 1-2 минут определяли базовую активность малатдегидрогеназы. Для этого использовали реакционную смесь, которая содержала все ингредиенты кроме глютамата, и только после определения базовой активности добавлялся глютамат. Активность ФК определялась по приросту активности после добавления глютамата. Для определения активности от конечной активности отнимали базовую активность МДГ. Активности обеих реакций рассчитывали по изменениям адсорбции за одну минуту. Также необходимо было провести спектрофотометрическое определение активности ГДГ в реакции восстановительного аминирования. Для определения активности ФК вычитали активность ГДГ в реакции окислительного дезаминирования глютамата. Для этого полученную активность ГДГ делили на 12, так как для этого фермента характерно постоянное соотношение скоростей прямой и обратной реакции равное 1/12. В результате, чистая активность ФК определялась путем определения полной активности в реакционной смеси с вычетом активности МДГ и ГДГ.

Так как описание методов выделения и очистки ФК из изучаемых объектов относится к результативной части, то их описания будут приведены в главе «Результаты исследования и их обсуждение».

Концентрацию белка определяли микробиуретовым методом по Бэйли (1965) при длине волны 330 нм на спектрофотометре типа Ultraspec-1100, Amersham-Bioscience и по методу Брэдфорда [4].

Все опыты проводились в 6-7 кратной повторности, и в таблицах приводится данные наиболее типичного из опытов. Все результаты были подвергнуты стандартной статистической обработке.

Результаты и их обсуждение

Для разработки ферментного диагностикума нами была изучена активность ФК у устойчивых, так и неустойчивых к стрессовым факторам сортов пшеницы и ячменя. Для изучения активности ФК были взяты семена пшеницы сортов различающихся по устойчивости к ржавчине. Признанным стандартом устойчивости к ржавчине является сорт Attila, а неустойчивым к ржавчине сортом является Саратовская-29. Результаты исследования этих двух контрастных по устойчивости к ржавчине сортов пшеницы представлены в таблице 1.

Таблица 1. Активность ФК семян сортов пшеницы, контрастных по устойчивости к ржавчине

№ п/п	Сорт пшеницы	Активность ФК мкМ NADH	% активность ФК
		на мл белка, 1мин
1	Attila	1007,07	170,52
2	Саратовская -29	453,13

Как видно из таблицы 1, устойчивый к ржавчине сорт «Attila» имеет активность ФК, которая на 84 процента выше, чем неустойчивый к ржавчине сорт «Саратовская-29». Такая существенная разница в активностях ФК свидетельствует об очень важной роли ферментного комплекса в формировании устойчивости растения пшеницы к ржавчине. Полученные нами результаты были подтверждены опытами по изучению активности ФК сортов другой злаковой культуры – ячменя. Результаты изучение представлены в таблице 2.

Таблица 2. Активность ФК семян сортов ячменя, контрастных по устойчивости к ржавчине

№ п/п	Сорт ячменя	Активность ФК мкМ NADH	% активность ФК
		на мл белка, 1мин
1	Унумли-арпа	532,33	251,54
2	Сауле	201,02

Как видно из таблицы 2, устойчивый к ржавчине сорт Унумли-арпа имеет активность ФК более чем в два с половиной раза выше, чем неустойчивый к ржавчине сорт ячменя Сауле. Такая громадная разница в активностях ФК говорит об очень важной роли ФК для устойчивости к ржавчине растений ячменя.

Результаты опытов с сортами пшеницы и ячменя, различающихся по устойчивости к ржавчине полностью подтвердили нашу гипотезу о том, что устойчивые к ржавчине сорта имеют очень высокую активность ФК, тогда как неустойчивые сорта имеют низкую активность ФК. Таким образом, активность ФК является важным диагностическим маркером для селекционной оценки устойчивости к ржавчине генотипов злаковых культур. Важная роль ФК для устойчивости к ржавчине объясняется тем, что ФК переводит аминогруппу глютамата на синтез аспартата - аминокислоты, в которой ржавчинные грибы не нуждаются. Это существенно ухудшает трофику грибка и приводит к его гибели [5,6].

Для Республики Казахстан одним из самых серьезных стрессовых факторов, резко снижающих урожайность злаковых культур, является засоление [7]. В нашей Республике со всей остротой стоит задача разработки современных методов тестирования генотипов злаковых культур на солеустойчивость, и эти методы должны основываться на глубоком знании механизмов адаптации растений к этому стрессовому фактору. Так как аммиак является одним из токсических агентов, возникающих при солевом стрессе [8]. На первый план выдвигается ферментный комплекс, который осуществляет катаболизм глютамата без выделения токсического аммиака. Поэтому очень важным явилось изучить активность этого фермента у генотипов злаковых культур, различающихся по устойчивости к солевому стрессу. Это изучение откроет пути для понимания процессов адаптации растений к засолению.

Семена изучаемых злаковых культур замачивали по вариантам в следующих растворах: 1 – Н₂О (контроль); 2 - 2% NaCl (хлоридное засоление), такой хлоридный тип засоления является характерным для Казахстана. Семена проращивали в течение 3-х суток, затем изучали активность ферментного комплекса в проростках.

Известно, что сорта пшеницы «Дауыл», «Толкын», «Арай» являются солеустойчивыми, а «Саратовская-29» и «Казахстанская-10» являются чувствительными к засолению. Для ячменя солеустойчивыми сортами являются сорта «Иран-4470» и «Би-10», в то время как чувствительными к засолению - сорта «Бота» и «Aрна». Данные по изучению активности ферментного комплекса в проростках пшеницы представлены в таблице 3.

Таблица 3. Активность ФК МДГ-ГОАТ у генотипов пшеницы, различающихся по устойчивости к солевому стрессу

№ п/п	Сорта пшеницы	Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ NADH на 1 мг белка
		контроль	хлоридное засоление
1	Дауыл	428,23	631,55
2	Толкын	505,77	607,61
3	Арай	459,01	663,70
4	Саратовская-29	517,07	428,75
5	Казахстанская – 10	522,46	451,84

Как видно из таблицы 3 именно генотипы пшеницы с выраженной устойчивостью к засолению обладают свойством увеличивать активность ФК при действии засоления, тогда как неустойчивые генотипы такой способностью не обладают. Они даже снижает активность ФК при засолении. Эти результаты получили подтверждения в опытах с сортами ячменя, различающимися по солеустойчивости. Была изучена активность ФК у солеустойчивых сортов «Иран – 4470» и «Би – 10». А также у чувствительных к засолению сортов «Бота» и «Арна». Результаты исследования активности ФК МДГ-ГОАТ в проростках ячменя представлены в таблице 4.

Таблица 4. Активность ФК МДГ-ГОАТ у генотипов ячменя, различающихся по устойчивости к солевому стрессу.

№ п\п	Сорта ячменя	Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ NADH на 1 мг белка
		контроль	хлоридное засоление
1	Иран-4470	255,85	376,68
2	Би-10	310,05	420,07
3	Бота	290,97	237,15
4	Арна	298,46	235,51

Как видно из таблицы 4, у устойчивых сортов ячменя в условиях солевого стресса происходит существенное возрастание активности ферментного комплекса, тогда как у не солеустойчивых сортов такое увеличение активности не наблюдается. Активность в этих случаях снижалась. Эти результаты говорят о важной роли ФК в процессах активной адаптаций злаковых культур к солевому стрессу. Эти результаты однозначно говорят о том, что солеустойчивые генотипы пшеницы и ячменя в отличие от неустойчивых генотипов имеют механизм активной адаптаций путем повышение активности ФК при действии засоления.

В заключении можно с уверенностью сделать вывод о том, что активность ФК тесно связана с устойчивостью генотипов злаковых культур к ржавчинным болезням и к засолению. Хотя механизмы устойчивости к ржавчине и засолению с участием ФК разные. Так, для устойчивости к ржавчине важным является высокий уровень активности ФК. Тогда как для устойчивости к засолению важным является механизм активной адаптаций путем повышения активности ФК при действии соли. Таким образом, нами установлено, что ФК является одним из важнейших ферментов азотного обмена, играющего очень важную роль в обеспечении жизнеспособности растений и их адаптаций к стрессовым факторам.

Литература

1. Регуляция метаболизма растений при засолении среды (Под ред. Л.К. Клышева.) Алма-Ата: Наука. - 1975. - С. 48-60.

2. M.K.Gilmanov, Zh.S. Kudiyarova, A.N.Sabitov, N. J.Omirbekova MDh- GOAT enzyme complex from wheat as new biosensor for glutamate determination// Biosensors and Bioelectronics, р.382, Shanhay, 2008

3. Колдасова А.С., Гильманов М.К., Шалахметова Г.А., Цветкова Б.М., Колдасова Ш.С. Методы изучения ферментного комплекса: малатдегидрогеназы-глютаматоксалоацетатаминотрансферазы, осуществляющего необратимое расщепление глютамата зерна пшеницы // Статьи методического сборника ИМБиБ "Методы молекулярной биологии, биохимии, иммунохимии и биотехнологии". – Алматы. - 1999. - С. 93

4. Bradford M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. – 1976. - Vol 72. – P. 248-254.

5. . Wagemaker MJ, Eastwood DC, van der Drift C, Jetten MS, Burton K, Van Griensven LJ, Op den Camp HJ. Argininosuccinate synthetase and argininosuccinate lyase: two ornithine cycle enzymes from Agaricus bisporus//Mycol Res. 2007 Apr;111(Pt 4):493-502. Epub 2007 Feb 8.

6. Wagemaker MJ, Welboren W, van der Drift C, Jetten MS, Van Griensven LJ, Op den Camp HJ. The ornithine cycle enzyme arginase from Agaricus bisporus and its role in urea accumulation in fruit bodies//Biochim Biophys Acta. 2005 Jan 11;1681(2-3):107-15. Epub 2004 Nov 24.

7. Панкова Е.И., Айдаров И.П., Ямнова И.А, Новикова А.Ф., Благоволин Н.С. Природное районирование засолённых почв бассейна Аральского моря география, генезис, эволюция. - М. -1996. – С.180

8. Ramon Serrano, Alonso Rodriguez-Navarro Ion homeostatis during salt stress in plants// Current Opinion in Cell Biology. - 2001. - Volume 13. - Issue 4. - Р. 399-404