Сравнительное изучение различных схем гормональной стимуляции и влияние их на выход морфологически полноценных эмбрионов у крупного рогатого скота мясного направления продуктивности

А.М. Омбаев, Б.И.Мусабаев, доктора с.-х. наук, Д.М.Бекенов, магистр, А.А.Спанов,

ТОО «Казахский НИИ животноводства и кормопроизводства»

givotnovodstvo@mail.ru

Аннотация. В статье описаны научные исследования одного из этапов метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, фазы гормональной обработки с целью определения наиболее оптимальной схемы индукции суперовуляции коров-доноров, которая влияет на выход морфологически полноценных зигот.

Ключевые слова: трансплантация эмбрионов, суперовуляция, доноры, гонадотропные гормоны, прогестагены, эстральный цикл.

I. Введение. Реформирование экономики в 90-х годах прошлого столетия привело к сокращению численности поголовья мясного скота и потере основной массы животных с высокими продуктивными показателями, к числу которых относятся высокоценные генотипы скота казахской белоголовой и аулиекольской породы, сочетающие в себе лучший генофонд мирового мясного скотоводства (герефорд, шароле, лимузин). В связи с этим первоочередной задачей животноводов является ускоренное восстановление численности поголовья и расширенное воспроизводство высокопродуктивных животных. Последнее предусматривает улучшение племенных качеств животных путём интенсификации селекционно-племенной работы для совершенствования существующих районированных пород крупного рогатого скота. Система селекции в скотоводстве основана на принципах точной генетической оценки и широкого использования генетически ценных быков производителей и ценных маток для ускорения повышения продуктивности стада. При этом внутрипородная селекция процесс длительный по времени. Новое направление в биотехнологии воспроизводства и селекции крупного рогатого скота – трансплантация эмбрионов - позволяет наиболее полно использовать естественный репродуктивный потенциал животных в короткие сроки. Трансплантация эмбрионов открывает огромные возможности в разведении и воспроизводстве КРС как с точки зрения повышения эффективности племенной работы, так и увеличения воспроизводства мясного скота. В области селекции КРС трансплантация обеспечивает более интенсивное размножение животных с высокой генетической ценностью и животных малочисленных пород, улучшает возможности контроля за наследственностью матерей племенных быков. Трансплантация эмбрионов создает более благоприятные условия для использования мировых генетических ресурсов: транспортировка глубоко охлажденных эмбрионов вместо животных, устранение ветеринарных препятствий в международной торговле, исключение необходимости адаптации импортированных животных к новым условиям среды. Селекционная программа совершенствования мясного скота в Казахстане предусматривает использование генотипа аулиекольской породы, генетические ресурсы которой недостаточны. Гормональная стимуляция генетически ценных маток и трансплантация эмбрионов позволяет быстро размножить, сравнительно с традиционными методами, генетически ценных животных.

В странах с высокоразвитым мясным скотоводством трансплантация эмбрионов широко применяется для размножения животных мясных пород.

Методом трансплантации получают высокоценных быков-производителей и интенсивно их используют для качественного улучшения стада. В России более 50% всех быков, используемых в производстве, получены путём пересадки зародышей. В США, Канаде и странах Западной Европы с развитым животноводством таким способом получены до 70% и более племенных быков-производителей [1].

II. Постановка задачи. Целью исследований явилось сравнительное изучение различных схем гормональной стимуляции и влияние их на выход морфологически полноценных эмбрионов.

Объектом исследования было маточное поголовье крупного рогатого скота аулиекольской породы. В качестве коров-доноров отбирали животных с высокими мясными показателями (с живой массой более 500 кг.), с хорошими воспроизводительными способностями, без гинекологических отклонений. Для вызывания множественного роста, созревания фолликулов и их овуляции использовали гонадотропные препараты, обладающие фолликулостимулирующей активностью (ФСГ и фоллигон), в сочетании с эстрогенами (эстрадиол), прогестагенами (прогестерон, CIDR) и простагландинами (клопростенол, эстрофан).

Для установления оптимальных доз и сроков введения гормональных препаратов, а также изыскания наиболее оптимальной схемы стимуляции суперовуляции гормональную обработку коров-доноров проводили по нижеследующим схемам.

Таблица 1. Схемы гормональной стимуляции суперовуляции

День эстрального цикла	Наименование препарата	Дозы
Схема 1
11	ФСГ	2,0 мл. (утро, вечер)
12	ФСГ	1,5 мл. (утро, вечер)
13	ФСГ + Клопростенол	1,0 мл.+4,0 мл. (утро, вечер)
14	ФСГ	0,5 мл. (утро, вечер)
15	Охота и осеменение	5 спермодоз
22	Нехирургическое извлечение эмбрионов
Схема 2
Без учета фазы полового цикла	CIDR + прогестерон + эстрадиол	0,5 мг+5,0 мл.+2,0 мл.
5	ФСГ	2,0 мл. (утро, вечер)
6	ФСГ	1,5 мл. (утро, вечер)
7	ФСГ + Клопростенол	1,0 мл.+4,0 мл. (утро, вечер)
8	ФСГ	0,5 мл. (утро, вечер)
9	Охота и осеменение	5 спермодоз
16	Нехирургическое извлечение эмбрионов
Схема 3
11	Фоллигон	2500 - 3500 И.Е.
13	Эстрофан	500 мкг
15	Охота и осеменение	5 спермодоз
22	Нехирургическое извлечение эмбрионов

Как видно из данной таблицы при обработке доноров по схеме 1 ФСГ вводили внутримышечно, в течение 4 дней, в лютеальную фазу полового цикла - дважды в день - утром и вечером, в убывающих дозах (начиная с 2,0 мл. до 0,5 мл.) с интервалом 12 часов. Клопростенол инъецировали в дозе 4,0 мл. двукратно с интервалом 12 часов. При отсчёте полового цикла день охоты принимался за нулевой. Через 12 часов после выявления охоты проводили трехкратное осеменение заморожено-оттаянной спермой быка породы шароле. Извлекали эмбрионы на 7-8 сутки после первого осеменения [2].

При обработке доноров по схеме 2 ФСГ применяли в сочетании с прогестагеновыми и эстрогенными препаратами. Предварительно, без определения фазы полового цикла вводили внутривагинально CIDR (внутривагинальный пессарий, пропитанный 0,5 мг. активного вещества) и внутримышечно - 5,0 мл. прогестерона и 2,0 мл. эстрадиола, затем с 5 по 8 дни цикла дважды в день инъецировали ФСГ в убывающих дозах (от 2,0 мл. до 0,5 мл.). CIDR убирали на 7-й день цикла, после чего двукратно с интервалом 12 часов инъецировали клопростенол (в дозе 2,0 мл.). В день охоты вводили ЛГ (в дозе 0,2 мг.) и через 12 часов после выявления охоты проводили трехкратное искусственное осеменение.

Гормональная обработка доноров по схеме 3 включает введение гонадотропного препарата Фоллигон (в дозах 2500=3500 И.Е.) на 11 день полового цикла, через две сутки инъецировали препарат эстрофан (500 мкг), трёхкратное искусственное осеменение с интервалом 12 часов и извлечение эмбрионов на 7-8 сутки после первого осеменения.

За сутки перед вымыванием эмбрионов прекращают кормление и поение коров-доноров. Непосредственно перед процедурой вымывания эмбрионов доноров обследуют ректально на наличие желтых тел в яичниках, проводят подсчет желтых тел с целью определения количества овуляций. Вымывание эмбрионов проводят нехирургическим методом под местной анестезией на 7-8-й день после первого осеменения [3].

Вымытые эмбрионы оценивали по качеству по 5 бальной шкале в соответствии с морфологическими критериями. Оценивают качество эмбрионов под микроскопом при 100-160 кратном увеличении. Основные критерии, по которым производится оценка качества эмбрионов, следующие: стадия их развития, соответствие уровня дробления возрасту от оплодотворения до извлечения, прозрачность перевителинового пространства, целостность и форма оболочки, размеры бластомеров и связь между ними [4, 5, 6].

III. Результаты Исследования проводили в хозяйствах по разведению крупного рогатого скота мясной продуктивности: ТОО «Кара-Найза» в Акмолинской области, ТОО «Ак-бидай» в Жамбылской области.

Таблица 2. Результаты гормональной обработки доноров

Показатели	Схема 1 1-я группа	Схема 2 2-я группа	Схема 3 3-я группа
Обработано доноров, гол.	20	14	6
Реагировало суперовуляцией, гол. - %	16 - 80,0	12 - 85,7	3 - 50,0
Желтых тел на донора, шт.	9,2±0,6	11,6±0,8	6,7±1,9
Вымыто эмбрионов всего, шт.	119	125	18
в т.ч. полноценных, шт. - %	104 - 87.4	99 – 79,2	14 - 77,8
на донора, шт.	6,5±0,5	8,3±0,9	4,7±0,9
Дегенерированные эмбрионы и яйцеклетки на донора, шт.	2,1±0,2	2,1±0,6	2,0±0,1

Как видно из данных таблицы 2, в 1-й группе при обработке коров-доноров по схеме №1 положительно реагировали суперовуляцией 16 гол. или 80,0 % от числа обработанных животных. Получено на донора 9,2±0,6 жёлтых тел. Всего вымыто у доноров 119 эмбрионов, из них полноценными были 104 эмбрионов (87,4%) или на донора 6,5±0,5 эмбрионов. Из общего числа вымытых непригодными для трансплантации (дегенерированных эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток) было 15 эмбрионов или 12,6 %, что в среднем на донора составило 2,1±0,2 эмбриона.

При гормональной обработке животных 2-й группы по схеме №2, суперовуляция наблюдалась у 12 гол. или 85,7 % от числа обработанных животных, что на 5,7 % больше, чем в 1-ой группе. Число овуляций на донора у животных во 2-ой группе составило -11,6±0,8. Всего вымыто 125 эмбрионов, по морфологической оценке пригодными к трансплантации были 99 эмбрионов (79,2 %), что составило 8,3±0,9 полноценных эмбриона на донора. Из общего числа вымытых, 26 эмбрионов или 20,8 % были непригодными для трансплантации, что в среднем на донора составило 2,1±0,6 эмбриона. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при обработке доноров по схеме №2 число овуляций и выход полноценных эмбрионов на донора выше, чем таковые показатели у доноров 1-й группы, обработанных по схеме №1.

При гормональной обработке по схеме №3 в третьей группе доноров положительно реагировали на гормональную обработку 3 коровы (или 50,0 %) из 6 обработанных животных. При ректальном исследовании в яичниках обнаружено 6,7±1,9 жёлтых тел на донора. Всего вымыто 18 эмбрионов, по морфологической оценке пригодными к трансплантации были 14 эмбрионов (или 77,8 %), что составило 4,7±0,9 полноценных эмбриона на донора. Из общего числа вымытых 4 эмбриона или 22,2 % были непригодными для трансплантации, что в среднем на донора составило 2,0±0,1 эмбриона.

Эффективность индуцированной полиовуляции оценивается полноценностью получаемых эмбрионов. Существуют разногласия о влиянии гормональной стимуляции на полноценность суперовулированных яйцеклеток, поскольку не имеется точных морфологических критериев для оценки качества получаемых зародышей. Полученные данные свидетельствуют о том, что при применении гонадотропного препарата - фоллигон - в дозах (3500 И.Е.), снижается выход полноценных эмбрионов. Снижение качества эмбрионов на фоне увеличения количества неоплодотворенных яйцеклеток может объясняться неполноценностью овулировавших яйцеклеток в результате влияния гормонального препарата. В сводной таблице 3 показаны результаты суперовуляторной реакции у доноров в зависимости от применяемых схем гормональных обработок.

Таблица 3. Зависимость суперовуляции от схем гормональных обработок

Схема гормональной обработки	Доноры, гол.	Овуляций на донора, шт.	Полноценные эмбрионы на донора, шт	Дегенерирован-ные эмбрионы на донора, шт.
Схема 1	20	9,2±0,6	6,5±0,5	2,1±0,2
Схема 2	14	11,6±0,8	8,3±0,9	2,1±0,6
Схема 3	6	6,7±1,9	4,7±0,9	2,0±0,1

Изучаемые схемы стимуляции суперовуляции, включали применение различных типов гормональных препаратов – гонадотропных, содержащих ФСГ, фоллигон, прогестагенов (CIDR, прогестерон) и эстрогенов (эстрадиол), простагландинов (клопростенол, эстрофан). В ходе экспериментов ставилась задача выявить наиболее результативную схему гормональной обработки доноров мясных пород.

В результате исследований установлено, что схема №1 является наиболее оптимальной для получения множественных морфологически полноценных эмбрионов от коров-доноров. Обработка доноров по схеме №1, обеспечивая лучшую оплодотворяемость коров после осеменения, позволяет получать более высокий (8,3±0,9) выход полноценных эмбрионов, пригодных для трансплантации и криоконсервации. Сочетанное применение экзогенных гормонов в схеме №2 позволяет обрабатывать доноров без выявления стадии половой охоты, при этом сокращаются сроки (до 15 дней) гормональной стимуляции коров-доноров.

Изучение суперовуляторной реакции в зависимости от доз гормональных препаратов показало, что оптимальной дозой препарата фоллигон является 3000 И.Е., с повышением доз экзогенных гормонов увеличивается число кистозных фолликулов, снижается количество овуляций и качество вымываемых эмбрионов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что наименьшая эффективность гормональной обработки отмечалась после применения схемы №3, при применении гонадотропного препарата - фоллигон - в дозах 3500 И.Е. Недостатком схемы является высокая степень вариабельности числа овуляций после введения гонадотропина и низкий выход полноценных эмбрионов. Снижение качества эмбрионов на фоне увеличения количества неоплодотворенных яйцеклеток может объясняться неполноценностью овулировавших яйцеклеток в результате влияния гормональных препаратов. Снижение оплодотворяемости на фоне высокой степени суперовуляции происходит в результате создания неблагоприятных эндокринных условий для гамет, а также нарушения мейоза некоторых ооцитов, созревающих в дополнительно овулирующих фолликулах [7].

IV. Выводы Впервые в Республике Казахстан разработана и внедрена технология трансплантации эмбрионов для ускоренного воспроизводства и совершенствования крупного рогатого скота приоритетных мясных пород с привлечением генофонда зарубежных пород.

Литература

1. Мадисон, В. Селекция и трансплантация [Текст]. //Молочное скотоводство. Племенное дело. Животноводство России, январь 2007. 14, 15, 16

2. Попов Д.В., Безбородов Н.В. Вестник Орловского государственного аграрного университета 2011. - № 4. - том 31

3. Середин В.А. “Биотехнология воспроизводства в скотоводстве: учебное пособие [Текст]. - Нальчик: ИЦ ”Эль-Фа”, 2004. - 472 с., ил.

4. Голубец Л.В. и др. Оценка качества ооцитов и эмбрионов крупного рогатого скота: учеб.-метод. пособие. – Гродно : ГГАУ, 2011 – 68 с.

5. Горбунов Л.В. Оценка жизнеспособности эмбрионов и эффективности технологии их криоконсервирования // Пробл. криобиол. 2003. № 4. С. 35-40.

6. Безуглый Н.Д. Низкотемпературная консервация яйцеклеток и эмбрионов в биотехнологии воспроизведения сельскохозяйственных животных : Автореф. дис. д-ра с.-х. наук : спец. 06.00.27 «биотехнология» - Харьков, 1995. - 48 с.

7. Sa Filho MF, Gimenes LU, Ayres H, Carvalho NAT, Carvalho JB, Baruselli PS. Dinamica folicular de novilhas Bos indicus tratadas com implante auricular de norgestomet ou com dispositivo intravaginal de progesterona. Acta Sci Vet 2005;33(Suppl 1):266 (abstract).