Федосеева Д.Г.

Тульский государственный университет, Россия

Влияние порообразователя полиэтиленгликоля на активность метилотрофных дрожжей Pichia angusta, инкапсулированных в золь-гель матрицы

Гетерогенные биокатализаторы на основе целых клеток микроорганизмов находят широкое применение в биотехнологических процессах и их контроле в экологических исследованиях. Использование микробных клеток в качестве биомассы в гетерогенных биокатализаторах устраняет необходимость выделения индивидуальных ферментов, и позволяет активному биоматериалу работать в условиях, близких к их естественной среде, а, следовательно, с более высокой эффективностью.

В последние десятилетия получило развитие инкапсулирование биоматериала в гибридные кремнийорганические золь-гель матрицы, которые обеспечивают сохранение биологической активности, эффективную защиту от механического, теплового и биологического воздействия. К достоинствам метода можно отнести  простоту и экспрессность получения нетоксичной матрицы, сохраняющей постоянный объем независимо от состава среды.

Значительное влияние на свойства получаемой матрицы оказывает не только природа биомассы, но и соотношение силановых прекурсоров. Для создания бимодальной золь-гель структуры дополнительно вносят органические полимеры, которые выполняют роль порообразователей. Чаще других используют нитрат целлюлозы, желатин, поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль, полиуретаны, гуммиарабик и полиамиды [1]. В данной работе в качестве порообразователя использовали полиэтиленгликоль, который позволяет избежать чрезмерного уменьшения пор при старении геля [2].

Значительное влияние на свойства получаемой матрицы оказывает соотношение силановых прекурсоров, используемых при формировании гибридных золь-гель матриц. Варьирование количества гидрофобной добавки МТЭС позволяет, с одной стороны, снизить токсичного воздействия на биоматериал добиться, а, с другой стороны, увеличить  механическую прочность золь-гель матрицы [3].

В работе метилотрофные дрожжи Pichia angusta BKM Y-2559 иммобилизовали в золь-гель матрицы на основе силановых прекурсоров тетраэтоксисилана (ТЭОС), метилтриэтоксисилана (МТЭС) и порообразователя полиэтиленгликоля (ПЭГ с различной молекулярной массой 2000 и 4000) с различным содержанием гидрофобной добавки МТЭС от общего объема силановых компонентов матрицы: 0%, 10, 33, 50, 67, 80, 83, 85, 90 и 100 об.% МТЭС.

На основе анализа градуировочных зависимостей различных биосенсоров проводили количественную оценку их чувствительности и выбор рецепторного элемента, наиболее подходящего для анализа реальных смесей.

Гетерогенные биокатализаторы на основе целых клеток являются биорецепторами каталитического типа, т.е. биологический ответ в таких системах обеспечивается ферментативными реакциями. Поэтому зависимости отклика биосенсора от концентрации субстрата хорошо описываются уравнением типа Михаэлиса-Ментен. Для снижения ошибок анализа ограничивались линейными участками градуировочных кривых. В работе получены 20 рецепторных элементов на основе клеток дрожжей P.angusta, иммобилизованные в золь-гель матрицу на основе ПЭГ-2000 или ПЭГ 4000, ТЭОС, с содержанием гидрофобной добавки МТЭС от 0 до 100%.

Ранее было исследовано влияние соотношения силановых прекурсоров (0, 10, 33, 50, 67, 80, 83, 90 и 100 % об. МТЭС по отношению к общему объему силановых прекурсоров) с использованием в качестве порообразователя ПЭГ-3000 на метрологические характеристики биосенсора [4]. Сравнительные характеристики чувствительности (коэффициент чувствительности и нижний предел обнаружения) показаны на рис. 1 и 2.

Рисунок 1 Сравнение коэффициентов чувствительности для биорецепторных элементов различного состава

Рисунок 2 Сравнение пределов обнаружения для биорецепторных элементов различного состава

 

Показано, что независимо от молекулярной массы ПЭГ максимальной чувствительностью характеризуются биорецепторные элементы с содержанием МТЭС 85 об.%, что, по-видимому, связано с наиболее благоприятными условиями инкапсулирования выбранных микроорганизмов (рис.5, 6). Максимальная чувствительность достигается при использовании ПЭГ-3000.

Для апробации биосенсора на основе рецепторного элемента, в состав которого входили инкапсулированные клетки дрожжей P.angusta, ПЭГ-3000, ТЭОС и с содержанием МТЭС 85 об.%, определяли содержание этанола в модельных образцах бродильных масс. В качестве референтного метода применяли газовую хроматографию (ГХ).

Таблица 1. Результаты определений этанола в модельных образцах бродильной массы

Время брожения, ч

Концентрация этанола, моль/дм3

Биосенсор с разработанным рецепторным элементом

Газовая хроматография

0

20±8

20±3

24

46±9

43±1

48

173±10

168±1

72

209±12

205±3

Статистический анализ результатов определения этанола,  показал, что выборки, полученные двумя методами, неоднородны по воспроизводимости, при этом значения концентрации этанола, определяемые с помощью биосенсора на основе выбранного гетерогенного биокатализатора и ГХ незначимо различаются между собой. Таким образом, биосенсор с разработанным биокатализатором может быть использован для мониторинга этанола в бродильных средах.

Литература:

                         1.               B. Samuneva Æ L. Kabaivanova // Sol-Gel Sci Technol. 2008. V.48. P.73–79

                         2.               Campas M., Marty J.-L. Encapsulation of enzymes using polymers and sol-gel techniques. In:  Immobilization of enzymes and cells / Ed. J. M.  Guisan. Totowa, New Jersey: Hunama Press Inc, 2006. P. 77-87

                         3.               Xiuhua W., Min H., Jianchun B., Wenwen T. et al.// Analytica Chimica Acta. 2012. V. 717. P. 61–66

                         4.               Cоколова О.А., Бурмистрова Т.В., Каманина О.А. // Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология – 2013». 2013. С. 57.

 

Работа выполнена в рамках Государственного Задания Минобрнауки РФ, гранта Президента Российской Федерации, договор № 14.Z56.14.330-MK и гранта РФФИ 13-03-97514