Камаева О.А.

Тульский государственный университет, Россия

Получение биорецепторных элементов на основе поливинилового спирта

Перспективными носителями для иммобилизации клеток микроорганизмов являются синтетические полимерные материалы, среди которых широкое распространение получил поливиниловый спирт (ПВС), так как химически и микробиологически стабилен, нетоксичен и биосовместим.

Целью настоящей работы является получение стабильных биорецепторных элементов иммобилизацией бактерий Gluconobacter oxydans в полимерную матрицу на основе раствора поливинилового спирта.

В работе был использован ПВС марки 16/1(Россия) с молекулярной массой 77000±1000 и ПВС марки Mowiol, (США) с молекулярной массой 1150001000, бактерии Gluconobacter oxydans sbsp. industrius B-1280.[1] В качестве преобразователя для измерения содержания молекулярного кислорода использовали pH-метр-иономер-БПК-термооксиметр ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 с электродом Кларка.

Для приготовления рецепторных элементов раствор полимера смешивали с бактериальными клетками, суспензию наносили на предметное стекло, высушивали в течение 24 часов при 20^°С и из полученной пленки вырезали рецепторные элементы размером 3x3 мм.

Для создания биосенсора рецепторные элементы закрепляли на кислородном электроде Кларка, который соединен с анализатором, позволяющим регистрировать содержание растворенного кислорода в кювете.

Важной характеристикой любого анализа является его селективность, т.е. возможность определения каждого компонента анализируемого объекта независимого от других. В случае биосенсорного анализа селективность определяется субстратной специфичностью микроорганизмов, используемых для формирования рецепторного элемента сенсора. Чем меньше субстратов способна окислять используемая культура, тем выше селективность анализа.[2]

Рис. 1. Портрет субстратной специфичности G. Oxydans sbsp. industrius

B-1280, иммобилизованных в пленку из полимеров ПВС и стекловолоконного фильтра.

Определение субстратной специфичности проводили на 4 день иммобилизации. При этом был получен портрет субстратной специфичности не совсем типичный для уксуснокислых бактерий. Отличительной особенностью субстратной специфичности бактерий иммобилизованных в матрицу является появление ответа на метанол, практически отсутствующий при использовании в качестве носителей стекловолоконного фильтра. Кроме того, на полимере ПВС наблюдается усиление ответа на глицерин, по сравнению со стекловолоконном фильтром. Максимальный отклик биосенсора наблюдался на глюкозу, который принимался за 100%. Следует отметить, что хорошо окисляются низшие спирты этанол, пропанол-1 и бутанол-1. Данные бактерии частично окисляют некоторые моно- и дисахариды, что связано с наличием альдозодегидрогеназ и гидролитических ферментов. Так как перед иммобилизацией бактерии были идентифицированы как подлинные Gluconobacter oxydans на оптическом микроскопе, можно предположить, что метод иммобилизации в полученном полимере влияет на субстратную специфичность.

В ходе дальнейших исследований были определены параметры биосенсоров на основе полученных биорецепторных элементов. В качестве модельного субстрата использовали глюкозу и этанол (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительная характеристика рецепторных элементов на основе полимерных матриц ПВС

Характеристики	Глюкоза		Этанол
	Плёнка ПВС с м.м 115000	Плёнка ПВС с м.м 78000	Плёнка ПВС с м.м 115000	Плёнка ПВС с м.м 78000
Операционная стабильность, %	4,1	3,9	6,1	6,1
Долговременная стабильность, суток	30	35	30	35
Чувствительность, мг/моль*с	0,0116±0,0006	0,0037±0,0007	0,0028±0,0002	0,0028±0,0002
Нижняя граница определяемых концентраций, мМ	0,78±0,04	1,03±0,08	1,52±0,05	1,21±0,05
Экспрессность, мин	5-7	5-7	5-7	5-7

Как видно из приведенных данных, все полученные биорецепторные элементы обладают хорошей операционной стабильностью (стандартное отклонение составляет от 3,2 до 3,9% при определении глюкозы и от 3,0 до 6,1% при определении этанола ). Коэффициент чувствительности и нижняя граница определяемы содержаний увеличивается по сравнению с модифицированным полимером. Экспрессность рецепторных элементов не меняется и составляет 5-7 минут.

Выводы. 1. Получены рецепторные элементы биосенсоров иммобилизацией микробных клеток G. Оxydans в матрицы из ПВС.

2. Установлено, что метод иммобилизации влияет на субстратную специфичность G. Оxydans при использовании пленок ПВС по сравнению с иммобилизацией методом адсорбции на стекловолоконном фильтре.

3. Получены биосенсорные устройства на основе иммобилизованных клеток G. Оxydans , обладающие хорошей операционной и долговременной стабильностью, а также высокой чувствительностью и низким пределом обнаружения анализируемого субстрата.

Литература

1. Луста К.А., Решетилов А.Н. Физико-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах. Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, 1998. № 34 (4). С. 339-353.

2. Понаморева О.Н., Решетилов А.Н., Алферов В.А. Биосенсоры. Принципы функционирования и практическое применение. – Тула: Изд-во ТулГУ, 2007. – 255с. ил.