Саперкин Н.В., Алексеева
И.Г.
Нижегородская
государственная медицинская академия
Оценка доказательств наличия устойчивости
бактерий к дезсредствам (по данным систематического обзора)
В настоящее
время проводится значительное количество исследований по изучению активности
антимикробных средств. В то же время довольно часто оказывается нелегкой
задачей получить доступ к достоверным результатам и доказательным данным о степени
резистентности бактерий к антисептикам и дезинфектантам. Это связано с
ограниченным числом штаммов, используемых в каждой конкретной работе, а также
применением авторами разнообразным методик диагностики резистентности к
биоцидам в разных странах. Взаимосвязь между устойчивостью in vitro
и неэффективностью дезсредства, по мнению некоторых исследователей, остается дискуссионным
вопросом. Цель нашего исследования
является обобщение и критический анализ различных данных о наличии и
распространенности устойчивости S. аureus и P. aeruginosa к действующим веществам дезинфектантов и
антисептиков путем проведения систематического обзора публикаций
соответствующих оригинальных исследований. Указанныы микроорганизмы были избраны
как одни из ведущих возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской
помощи, в ЛПО различного профиля и важный компонент госпитальной микрофлоры.
Методология поиска В период с декабря 2013
по февраль 2014 года проведен поиск информации в электронных базах данных PubMed и метапоисковой системе TRIP, без ограничений по
дате публикации и языку. Критерии отбора В работу включались
все описательно-оценочные исследования, касающиеся информации представленной ниже:
- наличие и
распространенность генов резистентности к биоцидам (в частности, генов smr, qacA,B,C,G,H для четвертичных
аммониевых соединений);
- результаты
сравнения значений минимальных ингибирующих концентраций (МИК) изучаемых
культур с таковыми для тест-штаммов микроорганизмов;
- количественная оценка устойчивости штаммов к ДС среди
изучаемых культур (в абсолютных числах и процентах).
Были
определены следующие критерии исключения: повторные
публикации, содержащие сходные данные; публикации исследований, представляющие
информацию только о резистентности S.aureus к
антибиотикам; документы, в которых приводилось только оценка методов
определения чувствительности к дезинфектантам на основе тест-штаммов
микроорганизмов. Критериями качества исследований, включенных в
настоящий систематический обзор, являлись четкое описание методики определения
чувствительности бактерий к дезинфектантам, а также наличие в тексте необходимых
цифровых данных, а именно точное указание на объем выборки, количество
чувствительных и устойчивых культур и т.п. Понятие устойчивости микроорганизмов
определялось как свойство микробов противостоять повреждающему действию
механических, физических и химических факторов. Учитывалось, что устойчивость может
быть и естественной, и приобретенной, возникающей в результате фенотипической
или генотипической изменчивости. При выполнении поиска использовались следующие
термины (одиночные и в сочетании с другими терминами): bacterial resistance, susceptibility, biocide, disinfectant, resistance gene, distribution of genes, minimal inhibitory concentration, antiseptic, staphylococcus aureus, chlorhexidine, triclosan, quaternary ammonium compound, benzalkonium chloride. Объектами
исследования послужили культуры S. aureus (включая MRSA и MSSA), изолированные
от пациентов и из внешней среды. Необходимо отметить, что в настоящий момент
систематический обзор исследований в отношении других актуальных возбудителей
ИСМП, в том числе ESKAPE-патогенов,
продолжается. Просмотр
результатов исследований и извлечение данных проводились независимо двумя
авторами. Структура поисковых запросов информации была выстроена по следующему
принципу:
- в поисковой системе TRIP: (resistance biocide staphylococcus aureus).
- в базах данных PubMed: ((resistance[ti] AND
("disinfectants"[Pharmacological Action] OR
"disinfectants"[MeSH Terms] OR "disinfectants"[All Fields]
OR "biocide"[All Fields])) AND ("staphylococcus
aureus"[MeSH Terms] OR ("staphylococcus"[All Fields] AND
"aureus"[All Fields]) OR "staphylococcus aureus"[All
Fields])) AND "staphylococcus aureus"[MeSH Terms]
Результаты и обсуждение Прежде всего необходимо
отметить, что использованные нами базы данных содержали достаточно ограниченное
число описаний оригинальных исследований, посвященных изучаемой проблематике.
Наряду с тем, что несколько публикаций не соответствовали критериям включения, ряд
ссылок и URL-адресов оказались на момент проведения нашего исследования
недействительными, хотя и были проиндексированы в использованных нами биомедицинских
базах данных. Хронологические рамки публикаций, вошедших в настоящее
исследование по изучению устойчивости S. aureus – 1960-2013 гг. В данный
систематический обзор вошло всего 25 работ, посвященных изучению стафилококка,
удовлетворявших условиям поиска. Отобранные публикации объединили 919 культур S.aureus.
В разное время подходы исследователей к оценке устойчивости микроорганизмов к
дезинфектантам и стиль представления данных менялись: количественная оценка
резистентных штаммов (в абсолютных числах и % от общего числа культур),
изучение минимальных ингибирующих и минимальных бактерицидных концентраций, выявление
и оценка распространенности генов устойчивости к антисептическим и
дезинфицирующим средствам. Спектр биоцидных средств, с которыми производились
эксперименты, отличает большое разнообразие. В то же время данные по
чувствительности/ устойчивости бактерий к ним весьма гетерогенны. Больше всего
исследований было посвящено вопросам изучения устойчивости микроорганизмов к
хлоргексидина биглюконату и бензалкония хлориду: 22 и 14 работ соответственно
(рис.). Триклозан был объектом изучения в меньшем числе исследований (5 работ).
Все указанные биоциды широко используются в медицинских учреждениях различного
типа, входят в рецептуры многих торговых марок, поэтому интерес к ним вполне
очевиден.
Рис. Количество
оригинальных исследований в зависимости от изучаемого биоцида (указаны только
дезсредства, имевшие более двух публикаций).
Данные
нашего систематического обзора позволяют говорить об определнных различиях в
методологических подходах к оценке чувствительности P.aeruginosa и S.aureus
к различным дезинфицирующим и антисептическим средствам. Описание подобных
особенностей для обоих микроорганизмов представлено ниже.
Анализ
работ по изучению устойчивости S. aureus Одним из первых
зарубежных сообщений об устойчивости S. aureus (n=16) к дезинфицирующим
средствам можно считать исследование, проведенное McNeil E. с
соавт. в 1960 году. Бактерицидная активность алкилдиметиламмония хлорида
авторами оценивалась путем обработки образцов ткани, а именно марли и муслина.
Установлено, что только 82,2% (106/129) образцов марли и 89,1% (90/101)
образцов муслина оказались обеззараженными полностью. Эффективность выбранного
исследователями ЧАС весьма изменялась при разных концентрациях. Кроме того, Wille
B. (1976) сообщил о наличии устойчивости у 5 изученных
культур к растворам формальдегида и хлорамина 80.
Выявление
устойчивости к дезинфектантам у стафилококков неразрывно связано с изучением
механизмов формирования такой резистентности, что представляется особенно
важным, учитывая более достоверные данные по механизмам
антибиотикорезистентности. В работах Kaulfers P.M.
(1995) имеются указания на плазмидный механизм формирования устойчивости
стафилококков, в частности, к ионам некоторых тяжелых металлов, гескахлорофену,
формальдегиду, бензалкония хлориду и хлоргексидина биглюконату. Влияние
эффлюксных систем ЧАС S. aureus на формирование устойчивости
исследовано DeMarco C.E. с
соавт. (2007). Авторами показано, что 49,1% изученных штаммов имели
соответствующие системы. Причем к этидия бромиду они присутствовали у 100%
культур, а к хлоргексидина биглюконату – у 96%. Особо необходимо отметить
работы, посвященные изучению распространенности генов резистентности к
дезинфектантам. В частности, нами определено 8 публикаций, касающихся qac,5
работ – гена smr. Имелся разброс
показателей: по данным разных авторов, гены qacA/B суммарно выявлялись в
0,7-94,6% S.aureus. В отношении только штаммов MRSA
от 2,1 до 94,6% штаммов были носителями подобных генов. Есть основания говорить
о гетерогенности показателей: от полного отсутствия (qacG) до наличия на высоком
уровне. Распространенность гена smr
находилась на уровне 3,6-44,2% стафилококков. Отмечалась также широкая
распространенность qacA
(0,6-33,7%), хотя показатели существенно варьировали. Более низкой она была для
qacС
(5,3-10,8%), qacН (3,3-7,1%) и qacВ (1,5%).
В ряде работ
устойчивость S. aureus
рассматривалась применительно к биопленкам. При изучении влияния трех разных
биоцидов, применяемых в медицинских учреждениях, на биопленки MRSA
установлено, что в рекомендуемых концентрациях все они были неэффективны в
отношении биоленок: до 11% микробных клеток MRSA выживали после
воздействия дезсредств (Smith K., Hunter
I.S., 2008).
В 4
исследованиях наличие устойчивости у стафилококка к дезинфектантам было изучено
путем определения МИК. В эксперменте Zhang Y.H. с
соавт. (2004) продемонострировано, что у 5,3% штаммов MRSA для иодофоров и
хлоргексидина биглюконата МИК была в 2 раза, а у 28,9% – в 1,5 раза по
сравнению с тест-штаммами. Сравнительную оценку устойчивости штаммов MRSA
и MSSA находим у Suller M.T., Russel
A.D. (1999). МИК для средств, содержащих ЧАСы,
являлась более высокой (в2-4 раза) относительно показателей для хлоргексидина и
триклозана (в 1,5-2). Резистентность MRSA к хлоргексидину на
высоком уровне (МИК более 100 мкг/мл) обнаружена у 13,3% культур (Takesue
Y.с соавт., 1991). В исследовании Smith K.с
соавт.
Указания на количественную оценку устойчивости штаммов к ДС
среди всех изученных культур содержались в отношении бензалкония хлорида
6,0-52,3%; бензетония 14-72%; хлогексидина биглюконата 7,0-13,3%;
акрифлавина 52,3%; повидон-йода 7,1%,
а также цетилтриметиламмония бромиду 3-55%. Кроме
того, в одной публикации содержалась подобная информация по воздействию дезинфектантов, содержащих ионы тяжелых
металлов. Минимальная
доля устойчивых культур фиксировалась к ртуть-содержащим средствам (2-10%),
максимальная – к кадмий-содержащему средству (49-50%) и иону AsO43- (49-51%).
Анализ
работ по изучению устойчивости P. aeruginosa Самой ранней публикацией в нашей работе была
статья Carson L.A. с
соавт. (1972), которые изучали факторы, влияющие на уровень резистентности P.aeruginosa
к четырем различным дезинфицирующим средствам. Объектом исследования послужил
штамм, полученный из внешней среды палаты аэрозольной терапии. Авторы описывали
значительную его устойчивость к изучаемым дезинфектантам по сравнению с
культурой микроорганизма, прошедшей «подращивание» на триптиказ-соевом агаре.
На примере
дезсредств, использующихся в контейнерах для хранения контактных линз, в работе
Lakkis C. с соавт. (2001) было
показано, что клинические штаммы P.aeruginosa (n=35)
отличаются по своей чувствительности к ним. МИК для полиаминопропилбигуанида
(0,00005%) и поликватерния-1 (0,001%) колебались от 6,25 до 100% при
температуре 37°С. Рост нескольких штаммов не был ингибирован 100%-ной
концентрацией дезинфектанта при комнатной температуре. Устойчивость
коррелировала с острой цитотоксической активностью по отношению к эпителиальным
клеткам роговицы, а также с геном exsA,
который кодирует белок, регулирующий цитотокчисность посредством комплексной
секреторной системы 3го типа.
Воздействие
поликватерния на P.aeruginosa,
содержащегося в растворах для ухода за линзами, также изучено Bruinsma G.M. с соавт (2006).
Показано, что устойчивость к ЧАС в большей степени зависела от величины
изоэлектрической точки, т.е. заряда поверхности бактериальной клетки, а не от
степени ее гидрофобности. Во многих случаях исследование устойчивости
синегнойной палочки к дезсредствам проводилось путем воздействия на тест-штаммы
этого микроорганизма. В частности, Abdel Malek
S.M. с соавт. (2010) установлено, что многократном
культивировании бактерии в среде, содержащей возрастающие субминимальные
ингибирующие концентрации биоцида 2-феноксиэтанола, P.aeruginosa демонстрировала
двукратное увеличение МИК на 10ом пассаже.
Одним из
направлений изучения резистентности данного возбудителя является оценка его
свойств в состоянии биопленок, находящихся на поверхностях из различных
материалов. При сравнительном изучении свободноживущих штаммов (n=45)
и фиксированных микробных клеток в условиях биопленок в работах Saito
K. (2009) обнаружено, что если в первом случае 5 из 6
тестируемых дезсредств полностью проявили активность, то в втором – наблюдались
существенные различия. Только средство Welpas привело к 100%-ному
бактерицидному эффекту. В отношении Isojin и этанола гибель
микроорганизмов отмечена в 88,9 и 60,0% случаев соответственно, Osvan
– только в 4,4%, а гибитан и Tego51 – отсутствие
бактерицидного эффекта.
Обезвреживание
биопленок также находилось в фокусе внимания Jurgens D.J.с
соавт. (2008). На примере тест-штамма РА14 ими было показано, что хлорамин в
исследуемый концентрациях при хлорировании воды не эффективен в отношении
биопленок этого микроорганизма. В то же время такое воздействие не повышало
степень резистентности бактерий к антибиотикам.
В работе Smith
K. и Hunter I.S.
(2008) обращалось внимание на необходимость исследования эффективности
обеззараживающих средств не только в соответствии со стандартными методиками (а
именно CLSI), но и в отношении
биопленок. Ни один из трех использованных биоцидов не оказывал 100%-ный
бактерицидный эффект при обработке поверхностей из различных материалов
(нержавеющая сталь, тефлон, полиэтилен). МБК для всех использованных препаратов
была в 10-100 раз выше по сравнению с планктонной культурой. Выживаемость
микробных клеток, в целом, доходила до 80%, без статистически значимых отличий
между материалами. В частности, на поверхностях, обработанных средством на
основе бензалкония хлорида (Anticide Bac-50),
выживаемость клеток в биопленках составляла 4-80%, на основе хлоргексидина
биглюконат (MediHex-4) – 30-80%, а в случае со средством,
содержащим триклозан, – 20-80%.
В обзоре Schweizer H.P. (2001) приводятся
данные о значении эффлюксной помпы MexAB-OprM
в формировании резистентности клинических и выделенных из внешней среды P. аeruginosa.
Ранее считалось, что подобное явление, в основном, связано с относительной
непроницаемостью внешней мембраны микробной клетки и ее хорошо развитым
липидным компонентом.
Loughlin M.F. с
соавт. (2002) изучали, какие фенотипические изменения (повреждение белков
наружной мембраны и липополисахарида) сопровождают появление устойчивости к
биоцидам и объясняет ли это механизм развития такой резистентности. В
эксперименте у двух штаммов P.aeruginosa была выработана
адаптивная устойчивость на стабильном уровне к бензалкония хлориду параллельно
с появлением антибиотикорезистентности к хлорамфениколу и полимиксину В у
одного штамма и к тобрамицину у другого. В отношении хлоргексидина, триклозана
и тимола устойчивости авторами не выявлено. Указания на обнаружение
устойчивости этого патогена к бензалкония хлориду имеются также и у Bridier
A. с соавт. (2011), хотя цифровые данные не были нам доступны
на момент проведения нашего систематического обзора и подготовки публикации. В
эксперименте Thomas L. (2000) была получена
устойчивость тест-штамма P.aeruginosa NCIMB 10421 к хлоргексидину путем
поэтапного воздействия концентрациями, меньшими МИК.
Относительно
немного работ, по нашим данным, в настоящее время посвящено изучению
устойчивости бактерий к дезинфицирующим средствам в условиях воздействия на
предварительно контаминированную поверхность. В частности, результаты
экспериментов Sagripanti J.L. c
соавт. (2000) с использованием широкого спектра биоцидов (7 торговых марок
дезсредств, 7 нативных действующих веществ) говорят о том, что устойчивость P.aeruginosa
к дезинфектантам на поверхностях, в среднем, в 300 раз превышает таковую при
исследовании в растворе. Это подчеркивает влияние поверхности на выраженность
устойчивости микроорганизма к различным дезсредствам.
В
параллельных опытах на 3 культурах P.aeruginosa в работах Brözel
V.S. с соавт. (1994) продемонстрирована способность
микроорганизма к выработке устойчивости к изотиазолону. Авторами расшифрован
механизм подобного явления, который заключался в подавлении активности белка Т (35кДа) в наружной мембране бактерий.
В одном
исследовании были обнаружены данные об отсутствии устойчивости микроорганизма
(содержание 105 КОЕ) к воздействию нетеплового аргона при 5-минутной
экспозиции (Ermolaeva S.A. с
соавт., 2011). В эксперименте на крысах показан бактерицидный эффект плазмы
аргона при лечении поверхностных ран, контаминированных P.aeruginosa.
С целью
обнаружения устойчивых клинических штаммов P.aeruginosa (n=178)
к двум биоцидам в Японии изучалось распределение МИК (Sugita T.,
1993). Все изученные штаммы были чувствительными к хлоргексидину (МИК составила
78-625 микроорганизмов/мл, а также не удалось получить к нему устойчивость in vitro.
В отношении бензалкония хлорида при МИК 625 микроорганизмов/мл чувствительными
были 84,3% культур (150/178). Затем у 6 культур (4,0% из 150) удалось
сформировать устойчивость, причем у 5 из них МИК возросла до 2500
микроорганизмов/мл, а у 1 – до 1250 микроорганизмов/мл. При МИК, равной 5000 микроорганизмов/мл, только
15,7% штаммов были чувствительными (28/178), т.е. данное значение концентрации
говорило о выявлении устойчивых вариантов. Исследователи пришли к выводу, что
устойчивость бактерий к бензалконию может быть выработана в эксперименте, хотя
и не на высоком уровне.
Резистентность
к четырем дезсредствам выявлялась в работе Maris P.
(1990) путем сравнения с МИК тест-штамма P.aeruginosa, которые были
предварительно определены для каждого биоцида (1024 мкг/мл для цетримида, 2
мкг/мл для хлоргексидина, 16 мкг/мл для гексахлорофена, 2 мкг/мл для хлорида
ртути, ). Только применительно к цетримиду значения МИК были однородными. У 98%
(из 118) культур она соответствовала МИК для тест-штамма и составляла 1024
мкг/мл. В отношении остальных веществ имелась гетерогенность значений. Устойчивость
к хлоргексидину колебалась от 21 до 22% (n=119) в зависимости от
полученной МИК: 20% штаммов имели МИК 32 мкг/мл, 22% - 16 мкг/мл, 21% – 8
мкг/мл. Для хлорида ртути получены следующие данные: у 24% культур МИК
составила 128 мкг/мл, у 28% – 64 мкг/мл (n=119). МИК
гексахлорофена составила 32 мкг/мл у 22% культур (n=117). Устойчивость
данного возбудителя к бензетония хлориду (0,1%) рассматривалась в работах Nakahara H.с соавт. (1984). Культуры выделены в условиях
университетской клиники Jikei. Удельный вес
резистентных штаммов P.aeruginosa составлял 51,6%
(176/341).
Указания на количественную оценку устойчивости штаммов к ДС
среди всех изученных культур содержались в отношении бензалкония хлорида
15,7-84,3%; бензетония хлорида 51,6%; нитрата серебра 5% (из 100 исследованных
культур); ртутьсодержащего средства 31-97,9%; кадмийсодержащего средства
40-97,1%; теллурит-иона 12%; арсената 10-74,5%; хромата 35%.
Вопросы
устойчивости к металлсодержащим биоцидам также рассматривались разными
авторами. В частности, по результатам Cervantes-Vega
C. с соавт. (1986), 36% (117/326) изученных клинических
штаммов проявляли резистентность к препаратам на основе металлов. Устойчивость
микроорганизма более чем к одному металлу обнаружена у 44% резистентных штаммов
(143/326).
У Vasishta R. с соавт. (1989) находим данные не просто о
выявлении устойчивых бактерий к нитрату серебра, но и о наличии «конкурентной»
резистентности к ионам кадмия и ртути (40% и 33% соответственно). Это выявлено
у штаммов P.aeruginosa,
характеризовавшихся устойчивости к нитрату серебра в концентрациях 20-70 мг/л.
Исследователями высказано предположение о взаимосвязи между устойчивостью этого
микроорганизма к различным металлам. Более высокая доля резистентных штаммов к
средствам на основе ртути, кадмия и мышьяка продемонстрирована в экспериментах Nakahara H. с соавт.: 97,9; 97,1 и 74,5% соответственно
(1984).
Работа Van
Cuyck-Gandre H. с
соавт. (1985) была посвящена изучению плазмидных механизмов резистентности к
антисептикам с применение двух разных методов оценки МИК хлоргескидина,
бензалкония хлорида и хлорида ртути. Устойчивость была установлена у культур P.aeruginosa (всего исследовано n=14)
, полученных от человека и животных, только в отношении хлорида ртути.
Выводы
Для объективной оценки устойчивости микроорганизмов к биоцидам необходимо
осуществлять систематические обзоры не только по антибиотикорезистентности, но
и устойчивости к дезинфицирующим и антисептическим средствам. Побоодные обзоры,
построенные с соблюдением принципов доказательной медицины, должны быть,
безусловно, доступны специалистам на русском языке. Ряд вопросов, касающихся
проблемы резистентности P. aeruginosa и S.aureus к дезинфицирующим средствам,
применяемым в практическом здравоохранении, остаются изученными не в полном объеме.
Это во многом связано с ограниченное числом исследований, результаты которых отличаются
существенной гетерогенностью. Это является основанием для проведения
молекулярно-генетического мониторинга устойчивости к дезинфектантам, внедрение
унифицированной методики изучения чувствительности микроорганизмов к биоцидам.
Литература
1. Шкарин, В.В.
Термины и определения в эпидемиологии: словарь. – Н. Новгород: Издательство
НГМА, 2010. – 300 с.
2. Alam, M.M., Kobayashi, N., Uehera, N., Watanabe, N. Analysis on distribution
and genomic diversity of high-level antiseptic resistance genes qacA and qacB in human clinical isolates of Staphylococcus aureus // Microbial drug resistance-mechanisms
epidemiology and disease. – 2003. – №9. – P. 109-121.
3. Anthonisen, I. L., Sunde, M.,
Steinum, T. M., Sidhu, M. S., H. Sørum. Organization of the antiseptic resistance gene qacA and Tn552-related β-lactamase genes in multidrug-resistant Staphylococcus haemolyticus strains of animal and human origins. Antimicrob.
Agents Chemother. – 2002. – № 46. – Р. 3606-3612.
4. Behr, H., Reverdy, M.E., Mabilat, C., Freney, J., Fleurette, J.
Relationship between the MIC levels of 5 antiseptics and presence of the qacA gene in Staphylococcus aureus (in French) // Pathologie et Biologie. –
1994. – №42. – P. 438-444.
5. Heir, E., Sundheim, G., Holck, A.L. The Staphylococcus qacH gene product: a new member of the SMR family
encoding multidrug resistance // FEMS Microbiology letters. – №163. – P. 49-56.
6. Jaglic, Z., Cervinkova, D. Genetic basis of resistance to quaternary
ammonium compounds – the qac genes
and their role: a review // Veterinarii Medicina. – 57. – 2012(6). – P.
275-281.
7. Mayer, S., Boos, M., Beyer, A., Fluit, A.C., Schmitz, F.J. Distribution
of the antiseptic resistance genes qacA,
qacB and qacC in 497 methicillin-resistant and –susceptible European
isolates of Staphylococcus aureus //
J of Antimicrobial chemotherapy. – 2001. – №47. – P. 896-897.