Корсун А.В., Гаврилюк В.Г., Савченко Н.О., Вінніков А.І.

Дніпропетровський національний університет імені Олеся Гончара

МОНІТОРИНГ РОЗПОВСЮДЖЕННЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНИХ ГЕПАТИТІВ СЕРЕД НАСЕЛЕННЯ М. ДНІПРОПЕТРОВСЬК

Зростання та поширення у світі інфекцій, спричинених вірусами гепатиту В і С, надзвичайно висока частота їх негативних наслідків обумовлюють актуальність вивчення патогенезу, клінічних форм, діагностики та лікування цієї хвороби. На сьогодні вірусні гепатити лишаються надзвичайно важливою проблемою в системі охорони здоров’я світу. За даними офіційної статистики, рівень захворюваності на гострі вірусні гепатити в Україні складає в середньому 23,5 на 100 тис. осіб: серед донорів крові відсоток виявлення складає 3,34-3,8%, серед медичних працівників –3,4-4,2%, серед дорослого населення в цілому – 1,7% [1].

Не дивлячись на те, що вірусні гепатити В і С відносяться до різних таксономічних родин, їх об’єднує здатність до реплікації в гепатоцитах, подібні клінічні прояви захворювань, а також те, що джерелом інфікування є хвора людина або вірусоносій. Високий рівень поширення цих інфекційних захворювань обумовлений швидким розповсюдженням збудників, значною кількістю шляхів та механізмів передачі, поліморфізмом клінічних проявів і значним ступенем хронізації процесу. Актуальність проблеми вірусних гепатитів пов’язана не тільки з високим рівнем захворювання, але й зі значною вірогідністю розвитку часто фатальних ускладнень як у дітей, так і у дорослих [2].

У наш час, ситуацію по вірусних гепатитах В і С епідеміологи розцінюють як украй несприятливу. формування «епідемії наркоманії» і ризикована сексуальна поведінка молоді, особливо підлітків, перетворюють медичну проблему парентеральних вірусних гепатитів у соціальну.

Гострота означеної проблеми спонукала до проведення моніторингу частоти виявлення вірусів гепатитів В і С в клінічному матеріалі від пацієнтів м. Дніпропетровськ за допомогою імуноферментного аналізу та методу полімеразної ланцюгової реакції. Дослідження проводились на базі медичної лабораторії «Сінево» м. Дніпропетровськ. Визначення титрів антигенів вірусів гепатитів і антитіл проти них проводили в зразках плазми крові у 391 обстежених осіб методом ІФА. Наявність геномної ДНК HBV і РНК HCV визначали методом ПЛР в плазмі крові 704 осіб.

З метою виявлення маркерів вірусів парентеральних гепатитів В і С на першому етапі досліджень проводили імуноферментний аналіз зразків плазми крові, відібраних у 391 обстежених осіб.

Із 35 обстежених методом ІФА на наявність сумарних антитіл до HBcAg позитивний результат, тобто наявність HBcAg у клінічному матеріалі, спостерігали у 7 випадках, що складало 20% від загальної кількості досліджених зразків (рис.1).

20% 80%

Рис.1 Відсоткове співвідношення сумарних антитіл до HBcAg виявлених в плазмі крові за методом ІФА

Примітка: – наявність HBcAg; – відсутність HBcAg.

У 28 осіб антитіла до HBcAg в клінічних пробах, узятих з плазми крові, виявлені не були. Кількість негативних зразків склала 80%.

Для виявлення сумарних антитіл до HCVAg було обстежено 356 пацієнтів з яких у 74 випадках спостерігали позитивний результат, тобто наявність HCVAg у клінічному матеріалі. Кількість позитивних зразків складала 20,8% (рис. 2).

20,8% 79,2%

Рис. 2 Відсоткове співвідношення сумарних антитіл до HCVAg виявлених в плазмі крові за методом ІФА

Примітка: – наявність HCVAg; – відсутність HCVAg.

У 282 осіб HCVAg в клінічних пробах виявлено не було. Кількість негативних зразків склала 79,2%.

Таким чином, при скринінговому досліджені плазми крові на маркери вірусних гепатитів у обстежених осіб методом ІФА  були отримані позитивні результати 20% у випадку гепатиту В і 20,8 % у випадку гепатиту С, що свідчить про досить високу розповсюдженість гепатитів серед населення м. Дніпропетровськ. Слід зазначити, що кількість осіб з підозрою на захворювання та частота виявлення гепатиту С більше ніж у десять разів перевищує показники по гепатиту В.

Актуальність проблеми гепатитів обумовлена вагомим соціально-економічним збитком і епідемічною значимістю цього захворювання, повсюдним поширенням, тяжкістю перебігу, високою частотою несприятливих результатів інфекції, активним включенням в епідемічний процес осіб репродуктивного і працездатного віку.

У діагностиці парентеральних гепатитів застосовують ряд методів імунохімічного та молекулярно- генетичного аналізів. Так, метод ІФА дозволяє діагностувати початкову стадію інфекції, простежувати і контролювати динаміку розвитку процесу, дозволяє получити швидку відповідь. Але такий діагностичний принцип може давати певну похибку в результатах, а наведені дані наукових досліджень при порівняльному аналізі застосування різних методів свідчать про перевагу ПЛР у абсолютній достовірності в діагностиці інфекційних захворювань. Разом з цим, методом ІФА визначають наявність антитіл, продукція й титри яких залежать від індивідуальних особливостей імунітету організму обстеженої особи. Тому для постановки точного діагнозу доцільним було провести дослідження по виявленню генетичного матеріалу вірусів гепатитів методом ПЛР.

Із 222 обстежених за методом ПЛР, позитивний результат, тобто наявність генетичних маркерів НВV у клінічному матеріалі, спостерігали у 36 випадках, що складало 16,2% від загальної кількості досліджених зразків (рис. 3).

16,2% 83,8%

Рис. 3 Відсоткове співвідношення позитивних/негативних результатів при дослідженні клінічного матеріалу на наявність генетичних маркерів НВV за методом ПЛР

Примітка: – наявність НВV; – відсутність НВV.

У 186 осіб ДНК HВV в клінічних пробах, узятих з плазми крові, виявлено не було. Кількість негативних зразків відповідно склала 83,8%.

Для виявлення генетичних маркерів НСV було обстежено 482 пацієнта, з яких у 160 випадках спостерігали позитивний результат, тобто наявність HCV у клінічному матеріалі. Кількість позитивних зразків складала 33,2% (рис. 4).

33,2% 66,8%

Рис. 4 Відсоткове співвідношення позитивних/негативних результатів при дослідженні клінічного матеріалу на наявність генетичних маркерів НСV за методом ПЛР

Примітка: – наявність НСV; – відсутність НСV.

У 322 осіб вірусу гепатиту С в клінічних пробах, узятих з плазми крові, виявлено не було, що відповідно склало 66,8%.

З метою отримання інформації про головні шляхи передачі і розповсюдження вірусів гепатитів В і С цікавим було дослідити частоту виявлення цих збудників у моно- і мікст- інфекціях (табл. 1 і 2).

Таблиця 1

Частота виявлення вірусу гепатиту В при моно- і мікст- інфекціях

Вид збудника	НВV		НВV+НCV		НВV+НIV		НВV+збудники інфекцій бактеріальної і вірусної природи, що передаються статевим шляхом
Кількість позитивних зразків (всього 36)	абс.показ.	%	абс.показ.	%	абс.показ.	%	абс.показ.	%
	23	63,9	5	13,9	1	2,8	7	19,4

В результаті проведених досліджень встановлено, що із 36 осіб, із зразків крові яких виділено ДНК вірусу гепатиту В, у 23 було виявлено даного збудника у вигляді моноінфекції (63,9%). У 19,4% пацієнтів НВV зустрічався у складі мікст- інфекцій із бактеріальними й вірусними збудниками захворювань, що передаються статевим шляхом. 13,9% позитивних зразків характеризувались водночас наявністю генетичного матеріалу НВV і НCV. І лише в 1 випадку виявлено їх асоціацію.

Таблиця 2

Частота виявлення вірусу гепатиту С при моно- і мікст- інфекціях

Вид збудника	НСV		НCV+НВV		НСV+НIV		НСV+збудники інфекцій бактеріальної і вірусної природи, що передаються статевим шляхом
Кількість позитивних зразків (всього 160)	абс.показ.	%	абс.показ.	%	абс.показ.	%	абс.показ.	%
	127	79,4	5	3,1	17	10,6	11	6,9

В таблиці 2 представлено данні обстеження 160 осіб, у зразках крові яких встановлено наявність РНК вірусу гепатиту C, у 127 було виявлено даного збудника у вигляді моно інфекції – це складало 79,4% від загальної кількості позитивних зразків. У 10,6% випадків в асоціації з НСV виявлено генетичні маркери НIV. У деяких ВІЛ- інфікованих (6,9% випадків) визначено наявність мікст- інфекцій із збудниками ЗПСШ бактеріальної та вірусної етіології. І лише у 3,1% випадків разом із РНК вірусу гепатиту C встановлено наявність ДНК вірусу гепатиту В.

Таким чином, отримані результати досліджень свідчать, що вірус гепатиту В у мікст- інфекціях найчастіше зустрічається зі збудниками захворювань із статевим шляхом передачі, то вірус гепатиту С – разом з ВІЛ. Це вказує на певні відмінності у способах розповсюдження вірусів парентеральних гепатитів і підтверджує літературні дані про те, що вірус гепатиту В частіше передається статевим шляхом, а вірус гепатиту С – парентерально. Вірус гепатиту B передається через контакт з зараженою кров’ю чи іншими біологічними рідинами. При статевих шляхах передачі вірус потрапляє в організм внаслідок порушення цілісності слизових оболонок і шкіри разом зі спермою і кров’ю. Доказами цього шляху передачі вірусу є виявлення ДНК у спермоплазмі, вагінальних секретах і цервікальному слизі носіїв вірусу, а також інфікування людиноподібних мавп спермою HBsAg та HBeAg позитивного носія. Джерелом інфекції гепатиту C є хворі з активним гепатитом і латентні хворі – носії вірусу. HCV-інфекція – це захворювання з парентеральним механізмом зараження – через інфіковану кров і її компоненти. Інфікування можливе при парентеральних маніпуляціях, в тому числі в медичних установах, включаючи стоматологічні процедури, через ін'єкційне обладнання, при акупунктурі, пірсингу, нанесенні татуювань, при наданні ряду послуг в перукарнях, однак при статевих контактах ймовірність захворіти на гепатит С набагато менше, ніж гепатитом В, і зводиться до мінімальних показників [4].

На наступному етапі досліджень було доцільним провести порівняльний аналіз кількісних показників наявності генетичних маркерів збудників гепатитів В і С у плазмі крові обстежених пацієнтів. Завдяки тому, що за методикою ПЛР можна провести не лише якісний аналіз, але й кількісно визначити концентрацію генетичного матеріалу збудників гепатитів у клінічному матеріалі, було встановлено титри ДНК НВV і РНК НСV у позитивних ПЛР- зразках (табл. 3).

Кількісний аналіз дає визначення вірусного навантаження. За кількісними показниками наявності копій геномних нуклеїнових кислот вірусів визначають ступінь вірусемії та прогнозують подальший перебіг інфекції.

Таблиця 3

Титри ДНК НВV у позитивних ПЛР-зразках

Ступінь вірусного навантаження	Низький	Середній						Високий
Титри ДНК вірусу гепатиту В у позитивних зразках,копій/мл	менше 7,5х10^2	7,5-9,9 (х10^2)	1,0-9,9 (х10^3)	1,0-9,9 (х10^4)	1,0-9,9 (х10^5)	1,0-9,9 (х10^6)	1,0-9,9 (х10^7)	від 1,0х10^8
Кількість позитивних зразків, абс. показ.	8	4	10	8	6	0	0	0
Кількість позитивних зразків, у %	22,2	11,1	28,8	22,2	16,6	0	0	0

При низькій віремії хронізація гострого гепатиту В або С дорівнює нулю. При середніх цифрах концентрації – хронізація спостерігається в однієї третини хворих. При високих цифрах рівня віремії гострий гепатит переходить у хронічну форму практично в 100% випадків [6].

Одержані дані свідчать, що найбільша кількість позитивних зразків із НВV характеризувалася середнім ступенем вірусного навантаження. Титри ДНК вірусу гепатиту В у 77,8% випадків коливались в межах від 7,5 х10² до 9,9 х10⁵ копій/мл. Найбільша кількість позитивних ПЛР- зразків, що складало 28,8% від їх загального числа, характеризувалась наявністю концентрацій ДНК вірусу гепатиту В від 1,0 до 9,9 (х10³) копій/мл. У 22,2% позитивних зразків містилось менше, ніж 7,5х10² копій вірусного матеріалу/мл.

При аналізі результатів дослідження показників вірусного навантаження по гепатиту С було встановлено, що найбільша кількість позитивних зразків із НСV характеризувалася середнім ступенем вірусемії, як і при гепатиті В. Але титри РНК вірусу гепатиту С у 95,6% випадків коливались в межах від 7,5 х10² до 9,9 х10⁷копій/мл. Найбільша кількість позитивних ПЛР- зразків, що складало 33,7% від їх загального числа, характеризувалась наявністю концентрацій РНК вірусу гепатиту С від 1,0 до 9,9 (х10⁴) копій/мл. І лише у 4,4% позитивних зразків містилось менше, ніж 7,5х10² копій вірусного матеріалу/мл.

Таблиця 4

Титри РНК НСV у позитивних ПЛР-зразках

Ступінь вірусного навантаження	Низький	Середній						Високий
Титри РНК вірусу гепатиту С у позитивних зразках,копій/мл	менше 7,5х10^2	7,5-9,9 (х10^2)	1,0-9,9 (х10^3)	1,0-9,9 (х10^4)	1,0-9,9 (х10^5)	1,0-9,9 (х10^6)	1,0-9,9 (х10^7)	від 1,0х10^8
Кількість позитивних зразків, абс. показ.	7	13	42	54	38	4	2	0
Кількість позитивних зразків, у %	4,4	8,1	26,3	33,7	23,8	2,5	1,2	0

Порівняння результатів обстеження зразків крові на наявність і кількість генетичного матеріалу збудників гепатитів В і С вказує на те, що РНК вірусу гепатиту С більш часто і більш у високих титрах, ніж ДНК вірусу гепатиту В, виявлявся у дослідних зразках клінічного матеріалу (рис. 5).

Така тенденція засвідчує те, що гепатит С важче піддається лікуванню порівняно із гепатитом В. Це можно пояснити тим, що головною особливістю вірусу гепатиту С є його надзвичайна мінливість, його швидка здатність утворювати так звані «квазивіди» – антигенні варіанти, які легко виходять з під контролю імунної системи, а антитіла проти них не проявляють захисної дії та є лише маркерами інфікованості [3].

Кількість генетичного матеріалу, копій/мл

Рис. 5 Частота зустрічаємості генетичних маркерів НВV і НСV у

різних титрах в дослідних клінічних зразках

Висока швидкість мінливості і репродукції вірусу гепатиту С призводить до збільшення вірусного навантаження, а, як відомо, чим вище значення цього показника, тим менш вірогідним є отримання позитивного результату при лікуванні. Все це сприяє хронізації інфекції в уражених осіб, ускладнює її діагностику і робить носіїв одним із основних факторів розповсюдження захворювання серед населення.

Порівняльний аналіз нуклеїнових послідовностей РНК ізолятів вірусу гепатиту С, отриманих в різних регіонах світу і навіть у процесі захворювання від одного й того ж самого пацієнта, виявив найвищу генетичну гетерогенність геному цього вірусу серед інших збудників вірусних гепатитів, яка має значний вплив на перебіг інфекційного процесу. Положення про значну генетичну варіабельність РНК вірусу гепатиту С покладено в основу теорій, що пояснюють тривалу персистенцію вірусу і уход від імунної відповіді, часту хронізацію захворювання, труднощі в терапії і створенні ефективних вакцинних препаратів. Різні генотипи вірусу неоднаково впливають на особливості перебігу хвороби, ефективність противовірусної терапії і, можливо, на результат захворювання [7, 8].

У сучасній класифікації Р. Simmonds (1998) виділяють 6 генотипів вірусу (ізоляти з високим рівнем генетичних відмінностей), відмінності яких пов'язані з високою швидкістю мутацій вірусного геному. У середині кожного генотипу виділяють субтипи – близькоспоріднені ізоляти в межах одного генотипу. Субтипи включають в себе ізоляти, які складаються з квазівидів – сукупності генетично близьких варіантів вірусу, структурно і антигенно відрізняючихся між собою, в межах одного індивідуума [7].

Інформація про генотип дуже важлива, оскільки вона дозволяє прогнозувати відповідь на лікування, його тривалість і рекомендувати дозу обраного препарату. Існує мінімум 6 генотипів НСV і безліч субтипів, що мають різну чутливість до інтерферонотерапії. Застосування методу ПЛР дозволило встановити у дослідних клінічних зразках 2 субтипи НСV генотипу 1, 3 субтипи генотипу 2 і наявність генотипів 3, 4 (рис. 6).

В Україні частіше інших зустрічаються генотипи 1, 2 і 3. Генотип 1 є найпоширенішим в світі та викликані ним ураження гірше інших піддаються лікуванню сучасними препаратами. Особливо це стосується підтипу 1b, прогноз перебігу хвороби при якому гірше порівняно з іншими різновидами. Інфекції обумовлені генотипами 1 і 4 лікуються 48- 72 тижні. У той час як підтипи 2, 3, 5 і 6 дають невелику кількість вірусу в крові і мають більш сприятливий прогноз. Такі захворювання можна вилікувати за 12- 24 тижні. Хвороба досить швидко відступає при використанні препаратів інтерферону і рибавірину. Генотип 3 викликає значне ускладнення – відкладання жиру в печінці (стеатоз), що сильно погіршує стан хворого[5].

Проведений моніторинг показав, що найчастіше від обстежених пацієнтів виявлялися субтипи 1а і 1b – частота зустрічаємості їх складала відповідно 40,0 та 28,8%. Таким чином, на генотип 1 НСV приходилось 110 із 160 позитивних випадків, що становило 68,8%. На субтипи 2а, 2в, 2с і 2і припадало відповідно 13,1, 6,8, 4,3 та 0%. Вони зустрічались у зразках крові 21, 11 та 7 пацієнтів. Таким чином, частота зустрічаємості генотипу 2 НСV складала 24,2%. Всього 5,7% випадків припадало на генотип 3 і 1,3% – на генотип 4. Генотипи 5а і 6 НСV виявлено не було.

1а 1b 2a 2b 2c 2i 3 4 5 6

Рис. 6 Частота зустрічаємості різних субтипів НСV у дослідних

клінічних зразках

субтипи НСV, визначені за ПЛР

Данні про географічне поширення вірусу гепатиту С, представлені в міжнародній базі даних нуклеїнових послідовностей генома вірусу Національної лабораторії Лос- Аламоса (Los Alamos National Laboratory), відображають нерівномірний розподіл генотипів вірусу по території земної кулі. Деякі генотипи зустрічаються по всьому світу, інші циркулюють в певних географічних зонах. Так, основні генотипи – 1, 2 і 3 (особливо їх субтипу: 1а – «Американський», 1b – «японський», 2а, 2b, 3а) найпоширеніші в світі, переважно в Америці, Західній Європі, на Далекому Сході, в Японії. Більш локальне поширення мають генотипи: 4 (домінує в Центральній і Північній Африці, Заїрі, на Середньому Сході), 5 (виключно в Південній Африці) і 6 (широко представлений в країнах Південно- Східної Азії) [7,8].

Правильне застосування сучасних молекулярних методів дозволяє оптимізувати наявні алгоритми противовірусного лікування і в деяких випадках одержати високі показники стійкої вірусологічної відповіді. Світовим стандартом лікування хворих хронічним гепатитом С є потрійна терапія інгібітором полімерази, пегільованим інтерфероном і рибавірином. Також зареєстровані 4 інгібітора протеази і 2 інгібітора полімерази, що дозволяє наблизити ефективність терапії до 100% і виключити зі схем лікування інтерферони [7].

Одержані дані свідчать про необхідність проведення систематичного молекулярно – епідеміологічного моніторингу для визначення закономірностей поширення генотипів вірусу гепатиту С в різних регіонах, що має важливе наукове і практичне значення.

Література

1. Быстрова Т. Н. Парентеральные вирусные гепатиты: этиология, эпидемиология, диагностика, профілактика / Т. Н. Быстрова – НГМА, 2010. – 180с.

2. Вірусні гепатити / Н. В. Харченко, В. Г. Порохницький, В. С. Топольницький. – К.: Фенікс, 2002. – 296 с.

3. Лобзин Ю.В. Вирусные гепатиты: клиника, диагностика, лечение / Ю. В. Лобзин, К. В. Жданов, Д.А. Гусев. – СПб: Фолиант, 2003. – С. 18-24.

4. Пути совершенствования эпидемиологической диагностики вирусных гепатитов В и С / Л.И. Шляхтенко, С.Л. Мукомолов, Л.Г. Сулягина и др. // Мир вирусных гепатитов. – 2006. – № 1. – С. 2-10.

5. Федоренко З.И. Гепатиты. / З. И. Федоренко // Журнал практического врача. – 2007. – №1. – С. 17 -19.

6. Шагинян В.Р. Молекулярно-биолоические методы в диагностике перинатальных вирусных гепатитов В и С / В.Р. Шагинян // Специфическая диагностика инфекционных болезней. – К., 2004. – С. 53-54.

7. Impact of HBV, HCV and HGV on hepatocellular carcinomas in Europe: Result of an European concerted action / S. Hadziyannis, J. Rodes, J. Bruix et al. // J. Hepatol. – 2007. – Vol. 26. – P. 139.

8. T.N Bystrov / J.V Mikhailov // Magazine "medial" № 2 – 2014. P. - 88-96.