Мотроненко В

Мотроненко В.В.

Національний технічний університет України «КПІ»

Аналіз впливу перемішування на культивування міцеліальних грибів

Використання глибинного культивування мікроорганізмів в об'ємі рідини широко використовується в біотехнологічній промисловості, і зокрема при культивуванні міцеліальних грибів (базидіоміцетів) [1].

Як показує аналіз літературних джерел [1-14], вплив перемішування на мікроорганізми в процесі глибинного культивування відіграє важливу роль. Для забезпечення максимального виходу кінцевої продукції необхідно підібрати режим перемішування таким чином, щоб до клітин мікроорганізмів надходили, в необхідній кількості, поживні речовини і кисень при збереженні їх високої життєздатність.

Особливо гостро дане питання постає при глибинному культивуванні міцеліальних грибів, так як підібрати оптимальний режим для їх культивування дуже складно враховуючи їх морфологічну будову, а саме розгалуженість міцелію. Метод глибинного культивування має ряд переваг в порівнянні з поверхневим вирощуванням. Механічне перемішування і безперервна аерація створюють сприятливі умови для доступу поживних речовин і кисню до всіх клітин міцелію, забезпечуючи однаково сприятливі умови для росту і накопичення продуктів метаболізму [1].

Проведений нами огляд літератури виявив, що інтенсивність перемішування суттєво впливає на ріст та здатність накопичувати біомасу міцеліальних грибів. В залежності від морфологічних властивостей грибів даний показник змінюється від 50 до 900 об/хв. (дивись таблицю 1) [3-14]. Всередньому при глибинному культивуванні міцеліальних грибів частота обертання перемішуючих пристроїв складає 120-180 об/хв.

Таблиця 1. Характеристика режиму перемішування

в залежності від виду продуценту, що використовується [3, 4, 6-14]

№ п/п	Продуцент	Число обертів мішалки, об/хв
1	Asp. Awamori - 460	48-300
2	Fusarium sambucinum	600-900
3	Ganoderma lucidum	50
4	Beauveria bassiana	180
5	Eremothecium ashbyi Guilliermond F340	150
6	Laetiporus sulphureus та Polyporus	120-150
7	Schirophyllum commune	180-190
8	Grifola frondosa	60-70
9	Laetiporus sulphureus	120
10	Trichoderma virens BKMF-1117	200
11	Chlorella vulgaris C-1	180

Наприклад для дослідження інтенсивності перемішування на ріст Fusarium sambucinum [4] використовували апарати BioFlo 110 (виробленівироблені США) об’ємом 1,3 л з двоярусною турбінною мішалкою відкритого типу діаметром 55 мм. Із графіку зображеного на рисунку 1, ми бачимо, що найбільш інтенсивно накопичення біотами відбувається при 700 об/хв., що відповіда лінійній швидкості перемішування 2 м/с. Подальше збільшення швидкості обертання призводить до зничення активності накопичування біомаси та активного спороутворення [4].

Рисунок 1 – Вплив інтенсивності перемішування на ріст Fusarium sambucinum

В статті [3] наводяться результати досліджень залежності біосинтезу культурою Aspergillus awamori ферменту глюкоамілази. Досліди проводили в промислових умовах використовуючи паралельно два ферментери об’ємом 5 м³ кожен, обладнаних одноярусними турбінними мішалками діаметром 600 мм (діаметр апарату – 2000 мм) барботером і 4 відбійними перегородками. Кількість обертів валу мішалки змінювалася від 48 до 300 об/хв. Як видно з графіку (рисунок 2) максимальний вихід ферменту спостерігається при питомій механічній енергії 6 кВт/м³. Подальше збільшення інтенсивності перемішування призводить до зниження синтезу внаслідок механічного пошкодження міцелію гриба. Також, було встановлено, що при інтенсивності перемішування менше 2 кВт/м³ міцелій гриба не отримував необхідної кількості кисню для інтенсивного накопичення біомаси і синтезу ферментів [3].

Також було встановлено, що інтенсивність перемішування впливає на зміну в’язкості культуральної рідини, очевидно, впливаючи, в першу чергу, на структуру міцелію, тобто на його морфологічні характеристики, що ми можемо бачити з гафіку представленого на рисунку 3, Виявлено, що в’язкість зменшується через 30-80 годин від початку ферментації. Саме на цей період припадає утворення дуже розгалужених гіф міцелію – чим менша інтенсивність перемішування – тим більше утворюється таких колоній. При збільшенні інтенсивності перемішування збільшується в’язкість і спостерігається тенденція до утворення укорочених гіф. Також, з графіку ми можемо бачити, що із збільшенням питомої механічної енергії, що затрачується на перемішування – в'язкість зростає в меншій мірі [3].

В [5] наводиться порівняння умов росту і дослідження морфологічних властивостей Laetiporus sulphureus (сірчано-жовтий труповик) в залежності від способу культивування, поверхневе культивування проводили на сусловому агарі впродовж 7діб, глибинне – в біореакторах з механічним перемішуванням або без нього та аерацією. Мікроскопічні досліди показали, що міцелій в поверхеій культурі складається з довгих септичних гіф з простими розгалуженнями без утворення міцеліальних пряжок (рисунок 4а) [5].

а) поверхнева культура б) глибинна культура

Рисунок 4 – Оптична мікрофотографія грибів Laetiporus sulphureus

В глибинних умовах міцелій здатний утворювати товстостінні хламідоспори (рисунок 4б), в культуральній рідині присутні різноманітні морфологічні структури – колонії з плоским центром і периферичним міцелієм, шаро- та грушподібні утворення, ниткоподібні фрагменти. При глибинному культивуванні відбувається більш швидке накопичення біомаси [5]. При глибинному культивуванні і відсутності механічного перемішування (рисунок 5а, 5б) утворюються чітко фрагментовані окремо розміщені структури із розгалуженим краєм за рахунок периферичних міцеліальних утворень [5].

Рисунок 5 – Оптична мікрофотографія грибів Laetiporus sulphureus без механічного перемішування

В умовах глибинного культивування і механічного перемішування (рисунок 6а, 6б) міцелій фрагментується на відносно невеликі сегменти, які не втрачають здатність до розмноження і накопичення біомаси, також, на растровому мікроскопі видно, що відбувається значне накопичення спорового матеріалу. З чого можна зробити висновок, що таких способом доцільно вирощувати посівний матеріал для подальшої ферментації [3].

а) збільшення в 500 раз б) збільшення в 5000 раз

Рисунок 6 – Оптична мікрофотографія грибів Laetiporus sulphureus
з механічним перемішуванням

Висновки: З усього сказаного вище видно, що при культивуванні міцеліальних грибів важливу роль відіграє інтенсивність механічного перемішування, при цьому, залежності від продуценту, що використовується, кількість обертів змінюється від 50 до 700 об/хв. В середньому кількість обертів мішалки лежить в межах 120-180 об/хв. Але в наведених роботах, не вивчено механізм дії перемішуючих пристроїв на здатність росту клітин мікроорганізмів, що викликає необхідність подальшого вивчення цього питання.

Література

1. А.С. Бхало Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре // Институт ботаники им. Н.И. Холодного. – Киев: Наукова думка. – 1988. – 144 с.

2. Костик, С.І. Математичне моделювання гідродинаміки перемішуючого пристрою з магнітним приводом [Текст] / С. І. Костик, Л. І. Ружинська, В. Ю. Шибецький, О. О. Ревтов // ScienceRise. – 2016. - №4/2(21). – C. 27-31.

3. Б.А. Устинников Оптимизация перемешивания культуральной жидкости при глубинном культивировании миктрорганизмов [Текст] / Б.А. Устинников, В.В. Иванов, Г.П. Георгиевский М.Г. Каукин // Ферментная и спиртовая промышленность. – 1987. – № 5. – С 54-58.

4. Неманова Е.О. Выбор режимных параметров при глубинном культивировании продуцента микропротеина [Текст] / Неманова Е.О., Русинова Т.В., Горшина Е.С., Бірювов В.В. // Известия МГТУ «МАМИ». – 2013. – № 1(15), т.4. – С. 271-277.

5. О.В. Киселева Морфологические особенности базидиального гриба Laetiporus sulphureus в поверхностной и глубинной культуре [Текст] / О.В. Киселева, П.М. Миронов, Ю.А. Литовка // Вести КрасГАУ. – 2012. – № 1. – С.91-95.

6. М.И. Леонтьева Условия аэрации как фактор регуляции биосинтеза эндополисахаридов и образования пеллет погруженной культуре Ganoderma lucidum [Текст] / М.И. Леонтьева, А.В. Барков, А.В. Автономов, Л.К. Краснопольская, А.А. Новиков // Башкирский химический журнал. – 2010. – № 3, т. 17. – С. 136-140.

7. В.Ю. Секова Глубинное культивирование энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana [Текст] / В.Ю. Секова, Н.А. Корнилова, А.В. Васильева // Успехи в химии и химической технологии. – 2010. – № 11 (116), т. XXIV. – С. 42-45.

8. В.Ю. Поліщук Динаміка росту і накопичення рибофлавіну аскоміцетом Eremothecium ashbyi Guillier [Текст] / В.Ю. Поліщук, М.І. Маланюк, О.М. Дуган // Наукві вісті НТУУ «КПІ». – 2014. – № 3. – С. 73-77.

9. Л.П. Дзигун Вплив умов культивування на ріст ксилотрофних базидіоміцетів Polyporus squamosus (HUDS.) FR. та Laetiporus sulphureus (BULL.: FR.) murrill [Текст] / Л.П. Дзигун, О.М. Дуган // Вісник аграрної науки Причорномор’я. – 2012. – № 1. – С. 178-185.

10. А.С. Бухало Ферментна активність вищого базидіального гриба Schirophyllum commune [Текст] / А.С. Бухало, О.М. Дуган, М.Р. Максимюк, В.М. Ліновицька // Вісник НАУ. – 2012. – № 3. – С. 154-159.

11. В.М. Ліновицька Підбір умов глибинного культивування Grifola frondosa як основи для створення біотехнології отримання лікувально-профілактичних препаратів [Текст] / В.М. Ліновицька, А.С. Бухало, О.М. Дуган // Наукові вісті НТУУ «КПІ». – 2011. – № 3. – С. 56-60.

12. Л.П. Дзигун Культивування дереворйнівного гриба Laetiporus sulphureus (BULL.: FR.) murrill (basidioycota) на рідких поживних середовищах [Текст] / Л.П. Дзигун // Український ботанічний журнал. – 2008. – № 1, т. 65. – С. 124-132.

13. И.В. Стручкова Микроскопические грибы Trichoderma virens – перспективне продуценты в микоризных сообществах [Текст] / И.В. Стручкова // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. – 2014. – № 3 (3). – С. 114-118.

14. Ф.Т. Мамедова Получние метана в процессе биотрансформации биомассы иммобилизованных клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae, использованных для получения молочной кислоты [Текст] / Ф.Т. Мамедова, О.В. Сенько, О.В. Маслова, Т.А. Махлисс, Е.Н. Ефременко // Вестник биологии. – 2015. – № 1, т.11. – С. 28-32.