РЕЗУЛЬТАТ
ПРИМЕНЕНИЯ СТВОЛОВЫХ/ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ ПИГМЕНТНОМ РЕТИНИТЕ В
ЭКСПЕРИМЕНТЕ.
ВВЕДЕНИЕ
Пигментный
ретинит — наследственное заболевание, характеризующееся поражением
пигментного эпителия и фоторецепторов. Первичное
звено патологического процесса – палочковые фоторецепторы, отвечающие за
периферическое, ночное, сумеречное зрение. По мере прогрессирования заболевания
возможно включение в патологический процесс колбочковой системы (2).
Пигментный ретинит является наиболее
распространенной причиной наследуемой слепоты. По
данным разных авторов, распространенность в популяции составляет 1 случай
на 3-5 тысяч человек [1].
Крысы линии Campbell –
экспериментальная модель животного с пигментной дегенерацией сетчатки. Существует
множество экспериментальных моделей животных с пигментной дегенерацией
сетчатки, в том числе линии собак, кошек, кур, свиней, мышей и крыс.
Разнообразие моделей связано с разнообразием генетических форм заболевания [3,4].
Существующие
методы лечения этой патологии на сегодняшний день недостаточно эффективны и
требуют поиска новых подходов [5,7].
Дальнейшие перспективы лечения заболеваний
сетчатки с использованием клеточных технологий во многом обусловлены активным
изучением стволовых клеток. Целью трансплантаций стволовых клеток является: стимуляция собственных стволовых клеток
организма и усиление репаративной регенерации. Будучи трансплантированными,
стволовые клетки способны встраиваться и дифференцироваться в зависимости от микроокружения
[5,6,7].
Для того чтобы оценить перспективы и возможность применения стволовых
клеток в клинической
офтальмологии, необходимо проведение детальных и глубоких
экспериментальных исследований, направленных на изучение их влияния на
состояние сетчатки.
Цель работы: Изучить влияние различных типов стволовых/прогениторных клеток (ретинального пигментного эпителия, нейрональных стволовых клеток и клеток цилиарного тела) при супрахориоидальном способе их введения на функциональное состояние и степень выраженности дегенеративных изменений сетчатки у крыс линии Campbell.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Работа проводилась на 38 крысах (76 глаз)
линии Campbell.
1 часть работы включала изучение
морфофункционального состояния
сетчатки у крыс линии Campbell в период
постнатального развития, использовано 8
животных (16 глаз)
2 часть работы включала изучение влияния различных типов стволовых/прогениторных
клеток на морфофункциональное состояние
сетчатки у крыс линии Campbell - использовано 30 животных (60 глаз). Это
исследование включало 3 серии экспериментов, в которых в опытный глаз
супрахориоидально вводили различные
типы клеток в количестве 300 000 в 2 мкл.
В
первой серии эксперимента, включающей 12 животных, вводили фетальные клетки
пигментного эпителия.
Во второй серии, включающей 8 животных,
вводили нейрональные клетки.
В третьей серии эксперимента, включающей
10 животных, вводили клетки цилиарного тела.
В контрольный глаз вводился такой же объем
сбалансированного физиологического раствора.
Перед началом введения клеточного материала
всем животным давали наркоз. Методика проведения наркоза предварительно была отработана на нелинейных крысах в возрасте 25-30 дней, затем адаптирована по отношению к животным линии Campbell.
Для безопасного супрахориоидального
введения клеточного материала и обеспечения точности его дозирования было использовано специальное оборудование -
штатив для фиксации животного и система для введения материала, которая
состояла из шприца Hamilton (серия 750LT), иглы
калибра 29G и канюли для супрахориоидального
введения; шприц фиксировался в
установке с микровинтом, позволяющим медленно и точно вводить необходимый объем
клеточного материала. Голову животного фиксировали за основание носа так, что
при необходимости было возможно осуществить ее поворот в ту или иную сторону. Специальные
распорки, расположенные на штативе для фиксации служили векорасширителями. На
конъюнктиву накладывали два параллельных шва-держалки, обеспечивающих доступ к
зоне инъекции и стабилизацию глазного яблока. Производили разрез конъюнктивы
между швами. Иглой делали косой надрез склеры, в который помещалась канюля для
супрахориоидального введения. Постепенно вращая микровинт, и обеспечивая тем
самым введение клеточной суспензии, медленно продвигали канюлю по направлению к
зрительному нерву. Когда суспензия
заканчивалась, канюлю медленно извлекали, вводя небольшое количество воздуха.
Он не позволял введенной клеточной массе выйти под давлением через склеральный
разрез. Благодаря косому входу края склерального разреза плотно смыкались, что
не требовало наложения шва. После удаления швов-держалок накладывали швы на
конъюнктиву 10:0. Производили инстилляции витабакта и индоколлира и подкожные
инъекции дексазона.
Электроретинография.
Регистрация ЭРГ производилась с помощью роговичного контактного
электрода; референтный электрод при этом размещался подкожно на загривке у
животного. Для количественной оценки интенсивности ответа производился анализ максимальной амплитуды b-волны ЭРГ. Другие компоненты ЭРГ (a-волна и off –
ответ) в исследовании не учитывались в связи с тем, что, во-первых, они слабо
выражены у данных экспериментальных животных
и, во-вторых, при развитии дегенеративных изменений в
сетчатке в постнатальном периоде у этих животных наблюдается
пропорциональное уменьшение волн
ЭРГ.
Морфологический анализ.
Срезы толщиной 20 микрометров
изготавливались на криотоме,
монтировались на предметном стекле и окрашивались иммуногистохимически
на рековерин; в качестве фонового окрашивания использовалась окраска ядер с
помощью бисбензимида. Измерения толщины наружного ядерного слоя (ONL-outer
nuclear layer) проводилось на флуоресцентных
микрофотографиях окрашенных срезов, сделанных в свете флуоресценции
бисбензимида. Параллельные микрофотографии в свете флуоресценции рековерина
использовались для верификации границ наружного ядерного слоя при сильной
степени дегенерации.
РЕЗУЛЬТАТЫ
И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании срезов сетчатки животных
линии Кэмпбелл было выявлено, что уже на 25 день постнатального периода в
наружном ядерном слое развиваются дегенеративные изменения - появляются очаги
дегенерации, не содержащие живых клеток (пустоты), толщина слоя уменьшается на
20-30% (Рис. 1-2), к 34 суткам
более чем на 50% , к 60 - на
80-90% и теряет свою
непрерывность.
На основании полученных данных был
определен оптимальный срок для введения клеточного материала - 19-20 день жизни
животного (глаза открываются – к концу второй
недели).
По данным электроретинографии на 34 день
постнатального развития амплитуда в-волны в опыте при введении клеток
пигментного эпителия составляла в среднем 36,6% от нормы, при введнии
нейрональных клеток - 12,3% и при
введении клеток цилиарного тела -7,6%.
Средняя амплитуда в-волны ЭРГ на
контрольных глазах составляла при введении клеток пигментного эпителия - 20,7%
, нейрональных клеток - 6,75%, клеток
цилиарного тела - 7,3% (Рис 1).
Полученные данные свидетельствуют о том,
что клетки ретинального пигментного эпителия при супрахориоидальном способе их
введения оказывают достаточно выраженное положительное влияние на
функциональное состояние сетчатки животных в возрасте 34 дней.
По результатам морфологических
исследований на 34 день постнатального
развития в опыте средняя толщина наружного ядерного слоя при введении клеток
ретинального пигментного эпителия
составила 31,6 мкм, при введении нейрональных клеток - 29,7 мкм, при введении клеток цилиарного тела -26,2 мкм.
В контроле в парных глазах - при введении
клеток ретинального пигментного эпителия толщина наружного ядерного слоя составила
29,6 мкм, при введении нейрональных
клеток - 25,5 мкм, при введении клеток цилиарного тела - 24,7 мкм. ( Рис. 2)
Таким образом, клетки ретинального
пигментного эпителия при супрахориоидальном способе введения оказывают
выраженное стабилизирующее влияние на процессы, развивающиеся в наружном
ядерном слое сетчатки крыс линии Campbell.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Установлено, что нейрональные клетки
и клетки ретинального пигментного
эпителия при супрахориоидальном способе
их введения на 19 день постнатального
развития в количестве 300 000 клеток в 2 мкл среды оказывают выраженное
положительное влияние на функциональное
состояние сетчатки крыс линии Campbell
к 34 дню постнатального развития, причем клетки пигментного эпителия оказывают
более выраженный эффект. Клетки цилиарного тела оказывают
слабоположительное влияние.
На основании результатов морфологического
исследования толщины наружного ядерного слоя сетчатки крыс линии Campbell установлено, что все три типа стволовых/прогениторных
клеток оказывают стабилизирующее влияние на процессы дегенерации сетчатки.
Наиболее выраженный эффект проявляется
при введении клеток ретинального
пигментного эпителия, а наименее выраженный – при введении клеток цилиарного
тела.
Выявлено, что введение
стволовых/прогениторных клеток в супрахориоидальное пространство опытного глаза
замедляет развитие процессов дегенерации парного глаза, что возможно связано со
стимуляцией продукции факторов роста и активацией эндогенных стволовых клеток.
Список литературы
1. Гинтер Е.К., Зинченко Р.А. Наследственные болезни в
российских популяциях // Вест. ВОГиС.- 2006. – Том 10. - № 1. – С. 106 – 124
2. Копаева В.Г. Глазные болезни. – М.:
Медицина, 2002 – 314 с.
3. Поплинская
В. А., Строева О. Г. Электронно-микроскопическое
и морфометрическое исследование развития наружных сегментов
фоторецепторных
клеток у мутантных крыс Campbell с наследственной
дистрофией сетчатки // Биологическая
серия – 1990. - № 1. – С. 5 - 14
4. Хараузов
А.К.,. Шелепин Ю.Е, Поздеев Н.В., Этингоф Р.Н.
Изменения
электроретинограммы крыс линии кэмпбэлл при развитии наследственной дегенерации сетчатки //
Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 1996.-82.- №8.— с. 9.
5. Anita Blixt Wojciechowski, Ulrica Englund, Cecilia Lundberg et al. Subretinal
Transplantation of Brain-derived Precursor Cells to Young RCS Rats Promotes
Photoreceptor Cell Survival // Exp. Eye Res.- 2002.- Vol. 75. - P. 23-37.
6. Bull ND, Martin KR. Using stem cells to mend the
retina in ocular disease // Regen Med.- 2009. – Vol.4. -
№ 6. P. 855-864.
7. Jin ZB, Okamoto S, Mandai M, Takahashi M. Induced pluripotent stem cells for retinal degenerative diseases:
a new perspective on the challenges // J Genet. - 2009.- Vol. 88. - №4. – P. 417-424
8.. Rivas MA, Vecino E Animal models and different therapies for treatment
of retinitis pigmentosa // Histol
Histopathol.- 2009. – Vol. 24. - № 10. – P.
1295-1322
Рисунки
Рис 1 Результаты электроретинографии
Рис. 2 Результаты морфологических исследований