Медицина / 7. Клиническая медицина

Ельчанинова Т. И.

ГУ «Днепропетровская медицинская академия МОЗ Украины»

Лабораторная диагностика антифосфолипидного синдрома.

Антифосфолипидный синдром (АФС) – широко распространенный аутоиммунный процесс, в основе которого лежит образование в организме бимодальных аутоантител, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными мембранными фосфолипидами и связанными с ними гликопротеинами.

Из мембранных фосфолипидов основными мишенями антифосфолипидных антител (АФА) являются: кардиолипин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидиловая кислота, а из белковых компонентов: бета 2 – гликопротеин – 1 (ГП – 1), аннексин V, протромбин (плазменный фактор II).

Большинство АФА принадлежат к классам Ig G и Ig M. Они блокируют фосфолипидно – белковые комплексы клеточных мембран эндотелия, тромбоцитов, других клеток, а также свободных везикул плазмы крови.

Это приводит к снижению тромборезистентности эндотелия, к активации тромбоцитарного гемостаза и дисбалансу коагуляционного механизма свертывания крови. Последний характеризуется развитием тромбофилии, которая сопровождается активацией факторов Vа, Xа, II и угнетением противосвертывающих механизмов (система протеина С, тромбодулина и фибринолиза). В результате действия АФА у больных появляется характерный симптомокомплекс: нарушение микроциркуляции в коже, органах, рецидивирующие микро – и макротромбозы вен и артерий, привычного невынашивания беременности. АФС может сопутствовать другим аутоиммунным, аллергическим, инфекционным и опухолевым заболеваниям.

Лабораторными критериями АФС являются развитие гипокоагуляции в фосфолипидзависимых тестах. Эта гипокоагуляция выявляется комплексом специальных лабораторных методик и обозначается как эффекты АФА, обладающих свойствами волчаночных антикоагулянтов (ВА). На долю антител обладающих свойствами ВА, приходится около 70 % всех АФА.

В соответствии с рекомендациями субкомитета по АСФ/ВА комитета по научной стандартизации Международной ассоциации по тромбозам и гемостазу (1990, 1995, 2010), используется 3 – х этапная лабораторная диагностика АФС, которая направлена на выявление эффектов аутоантител, обладающих свойствами волчаночных антител [1].

Первый этап – скрининговый. Включает выполнение на бедной тромбоцитами плазме (БТП) фосфолипидзависимых тестов: АПТВ со специальными реагентами, тестов с разведенными змеиными ядами, активирующими комплекс факторов X, V, протромбиновым тестом с разведенным (ослабленным) тромбопластином и коалиновым тестом.

Положительным результатом скрининга можно считать выявление удлинения времени свертывания на 20 % в двух и более тестах первого этапа диагностики.

В АТПВ вместо обычной коалинкефалиновой смеси используют специальные реагенты, высокочувствительные к ингибированию антителами фосфолипид – белковых комплексов.

С этой целью рекомендуются диагностикумы «Platelin – LS» фирмы Organon Teknika и «Staclot – LA» фирмы Stago, или применение реагентов АПТВ (ВА+) и АПТВ (ВА-) – фирмы Технология – Стандарт.

Вторым этапом проводится коррекционная проба (тест смешивания) – смешивание исследуемой плазмы с контрольной нормальной плазмой и повторное выполнение тестов в данном «миксе». Если показатели приходят к норме, то причиной их исходного удлинения служит дефицит одного или нескольких факторов свертывания. Если же удлинение времени образования сгустка в данных тестах сохраняется (или недостаточно укорачивается), то делается заключение о присутствии в плазме пациента ингибитора коагуляции (им может быть и ВА).

Инкубировав плазму пациента и ее микс с нормальной плазмой в течение 1 ч. при 37 °С и повторив исследование тестов, можно дифференцировать характер данного ингибитора: если его эффект усилился (время в тестах стало больше, чем исходное), то он является специфичным (блокирует фактор коагуляции, чаще – VIII), если же его действие сохранилось на прежнем уровне после часовой инкубации образца, то он расценивается как неспецифический, разновидностью которого является ВА.

Третий этап – коррекционные (подтверждающие) тесты проводятся следующим образом: в тех пробах, в которых была выявлена гипокоагуляция, тесты повторяются при добавлении в избытке компенсирующих фосфолипидных мембран (ФМ). В качестве последних используют разрушенные тромбоциты донора, фосфолипидные липосомы или гексагональные фосфолипиды.

При наличии в плазме АФА со свойствами ВА введение избытка фосфолипидных мембран приводит к устранению гипокоагуляции и нормализации результатов. В то время как при наличии в плазме других ингибиторов свертывания гипокоагуляция (при добавлении ФМ) не коррегируется.

Ключевыми показателями алгоритма являются два следующих отношения: 1) времени свертывания плазмы пациента к свертыванию нормальной плазмы (так называемое «скрининговое» отношение). При его значении, превышающем 1,2, выполняется постановка реакции с подтверждающим реагентом. 2) «Подтверждающее» - отношение времени свертывания плазмы пациента со скрининговым реагентом (имеет лимитированную концентрацию фосфолипидов) к таковому его же плазмы с подтверждающим реагентом, содержащим избыточное количество фосфолипидов.

Положительным тест считается тогда, когда подтверждающее отношение составляет более 1,2. При этом уровень в плазме ВА более 2,0 расценивается как высокий, от 1,5 до 2 – средний и от 1,2 до 1,5 – низкий.

Для выявления ВА необходимо строгое соблюдение требований преаналитического этапа диагностики, заключающихся в обязательном двукратном центрифугировании плазмы перед исследованием, а также в выполнении тестов в «свежей плазме», не подвергающейся заморозке.

Не менее важным требованием диагностики ВА является использование специальных контрольных материалов с известным уровнем ВА. Для более достоверной трактовки изучаемых результатов можно также рекомендовать одновременное определение в крови белков острой фазы воспаления (СРБ и др.), что позволяет дифференцировать транзиторное присутствие ВА при различных видах патологии с «истинным», постоянным его наличием в крови, характерным для АФС.

В практику внедрен алгоритм [2] определения волчаночного антикоагулянта с выполнением трех диагностических тестов, в которых используются различные по чувствительности к ВА тест – системы: АПТВ, лебетоксовый тест (с разведенным ядом гюрзы среднеазиатской) и протромбиновое время с разведенным тромбопластином. По каждой из методик выполняется исследование с чувствительным и не чувствительным к ВА реагентом.

После выполнения шести тестов проводится расчет серии отношений, по результатам которого делается заключение о наличии в крови пациента ВА:

R₁ = t₁/t₂; R₂ = t₃/t₄.

Нормализованное отношение (НО) = R₁/ R₂; где t₁ – время свертывания БТП больного с АПТВ – реагентом ВА (+);

t₂ – время свертывания контрольной БТП с АПТВ – реагентом ВА (+);

t₃ – время свертывания БТП больного с АПТП – реагентом ВА (-);

t₄ – время свертывания контрольной БТП с АПТВ – реагентом ВА (-)

Примечание: Нормализованное отношение позволяет количественно оценить гипокоагуляционный эффект ВА.

Проведение иммунологических тестов позволяет дополнительно подтвердить наличие ВА в плазме пациента: 1. Наличие ВА в плазме пациента в двух или более пробах с интервалом между исследованиями не менее 12 недель.

2. Наличие антител (АТ) к кардиолипину Ig G и/или Ig M – изотопов в сыворотке или плазме пациента или высоком титре (>40 GPL или MPL или свыше 99 перцентилей) с интервалом между исследованиями не менее 12 недель (определение ИФА).

3. Наличие антител к β₂ – гликопротеину – 1 и/или Ig M – изотопов в сыворотке или плазме пациента в титре более 99 перцентилей с интервалом между исследованиями не менее 12 недель (определение ИФА).

В зависимости следующим категориям:

ü Категория I – позитивность более чем по одному лабораторному признаку (в любой комбинации);

ü Категория IIа – позитивность только по ВА;

ü Категория IIб – позитивность по АТ к кардиолипину;

ü Категория IIс – позитивность только по АТ к β₂ – гликопротеину – 1.

Комплексность анализа (определение АТ тремя методиками) связана с тем, что ни один из способов диагностики не охватывает все возможные типы аФЛ [3].

· Антитела к кардиолипину – это антитела к дифосфатидилглицеролу клеточных мембран, являются ведущим признаком наличия АФС. Антитела к кардиолипину являются основной фракцией антител к фосфолипидам.

· Антитела к фосфатидилсерину взаимодействуют с ФЛ мембран тромбоцитов и эндотелиальных клеток, вызывают их повреждение, что влечет за собой развитие тромбозов и тромбоэмболий.

· Антитела к β₂ – гликопротеину.

β₂ – гликопротеин (аполипопротеин Н является кофактором необходимым для взаимодействия АФА с фосфолипидами. Обнаружение этих антител одновременно с выявлением антител к кардиолипину повышает специфичность диагностики АФС.

· Антитела к аннексину V.

Аннексин V – (анхорин с II, плацентарный антикоагулянтный протеин I, кальфобиндин I, кальций – зависимый фосфолипидсвязывающий протеин 33, плацентарный протеин 4) содержится во многих тканях, главным образом в эндотелии и плаценте. Он обладает выраженными антикоагулянтными свойствами in vitro. Отмечена важная роль этих антител в развитии тромбозов.

· Антитела к протромбину – являются патогенными и напрямую ингибируют факторы коагуляции – это приводит к удлинению времени фосфолипидзависимых коагуляционных тестов. Протромбин обеспечивает создание на мембране поврежденных клеток комплекса факторов V_а, X_а и фосфолипидов. В присутствии ионов кальция образуется протромбиновый комплекс, который переводин протромбин в тромбин, который активирует переход фибриногена в фибрин.

Литература:

1. Amout I. Antiphospholipid syndrome: diagnostic aspects of lupus anticoagulants. Thromb. Haemost. 2001; 86: 83 – 91.

2. Момот А. П. Патология гемостаза, принципы и алгоритмы клинико – лабораторной диагностики. – СПБ. : Форма Т, 2006. – 208 с.

3. Кузник Б. И., Стуров В. Г., Максимова О. Г. Геморрагические и тромботические заболевания и синдромы у детей. Новосибирск, «Наука». – 2012. – 456 с.