Іванченко К.В., Гаврилюк В.Г., Вінніков А.І.

Дніпропетровський національний університет імені Олеся Гончара

МОНІТОРІНГ ВИЯВЛЕННЯ СТАФІЛОКОКІВ В РІЗНИХ БІОТОПАХ ОРГАНІЗМУ ПАЦІЄНТІВ ЛІКАРНІ №9 М. ДНІПРОПЕТРОВСЬК

На фоні успішної боротьби з більшістю інфекційних захворювань стафілококова інфекція на сучасному етапі представляє труднощі для діагностики та лікування. У той же час стафілококові захворювання в останні роки розповсюджуються все ширше, нерідко протікаючи більш важко, ніж 30-40 років тому. Від хвороб, викликаних стафілококами , зараз помирає більше людей, ніж від черевного тифу, дизентерії та дифтерії разом узятих. Вони характеризуються великою різноманітністю локалізації та клінічних проявів, що ускладнює діагностику. Надзвичайна гострота і важливість проблеми стафілококової інфекції, званої "стафілококовим лихом", обумовлена широким розповсюдженням у всіх розвинених країнах стафілококових захворювань, збільшенням числа важких післяопераційних і внутрішньолікарняних ускладнень. Однією з основних причин цього є поява стійких штамів стафілокока, пов’язаних з широким застосуванням хіміотерапевтичних препаратів, до яких ці мікроорганізми набувають стійкості швидше, ніж більшість інших збудників.

Ефект лікування стафілококових захворювань підвищує поєднане використання препаратів фагів з антибіотиками і ферментами. Проте в даний час зусилля дослідників спрямовані в основному на розробку тактики застосування антибіотиків при лікуванні окремих хворих і, на жаль, досі вкрай недостатня увага приділяється розробці стратегії антибіотикотерапії в умовах стаціонару, міста і тим більше всієї країни. Метою даного дослідження було визначення частоти зустрічаємості стафілококів в різних біотопах організму людини та встановлення ступеню резистентності їх до антибіотиків.

Дослідження проводилось на базі КЗ «Міської клінічної лікарні №9 ДОР» м. Дніпропетровськ. Об’єктом досліджень були штами умовно-патогених мікроорганізмів різних таксономічних груп, виділені із дихальних шляхів, статевих органів, гнійних ран, крові,шкіри, фекалій, рвотних мас 215 обстежених осіб. Дослідження на наявність збудників уражень здійснювали відповідно до Наказу №535 МЗ СРСР «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно- профилактических учреждений» [6]. Чутливість до антибіотиків визначали лише для чистих культур ідентифікованих штамів. Чутливість виділених від пацієнтів штамів встановлювали за допомогою диск-дифузійного методу. Вибір антибіотиків був здійснений відповідно до вимог наказу № 167 МОЗ України «Про затвердження методичних вказівок щодо визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів». [8]. З метою визначення видового спектру збудників інфекцій при різних ураженнях було проаналізовано 234 зразки біологічного матеріалу від пацієнтів із 7 відділень КЗ «Міська клінічна лікарня №9 ДОР» (рис. 5.1).

Рис. 5.1 Походження зразків досліджуваного матеріалу

Більшість зразків було отримано з двох гінекологічних відділень – 33,8% (79), значну кількість матеріалів отримано від осіб з жіночої консультації – 19,2% (45) та відділення урології – 18,8% (44). Із терапевтичного відділення було одержано 13,7% (32) зразків. Загальна частка матеріалу з інших відділень разом становила 14,5% (34). Рис. 5.2 Частота виявлення різних видів мікроорганізмів

В усіх досліджених зразках було проведено виявлення наявності бактерій з визначенням переважаючих груп мікроорганізмів. З 234 зразків наявність бактерій як збудників уражень було підтверджено у 164 (70,1%). У 70 зразках бактеріологічними методами збудників не виявлено, що дає змогу констатувати стан здоров’я (при плановому диспансерному обстеженні) або припускати вірусну етіологію уражень у разі прояву патологічних змін.

Загалом у 164 зразках було виявлено 183 штами патогенних та умовно-патогенних збудників інфекцій бактеріальної, грибкової та протозойної етіології (рис. 5.3). Ідентифікацію бактеріальних та грибкових збудників уражень здійснювали за результатами вивчення тінкторіальних, культуральних та фізіолого-біохімічних ознак, а мікобактерії виявляли в мазках, забарвлених за методом Циля-Нільсена, найпростіших виявляли в мазках, забарвлених за методом Романовського-Гімзи з подальшим проведенням імунофлуоресцентної реакції.

Відповідно до походження з різних біотопів обстеженних осіб було виділено штами умовно-патогенних мікроорганізмів: більшість були ізольовані з урогенітального тракту (УГТ) – 74,8% (175), з верхніх дихальних шляхів (ВДШ) – 15,0% (35), з шлунково-кишкового тракту (ШКТ) – 5,1% (12), зі шкіри – 3,8% (9), з крові – 1,3% (3) (рис. 5.3).

Рис. 5.3 Частота виявлення мікроорганізмів з кількісним показником перевищуючим норму

За результатами проведеної ідентифікації було встановлено, що найбільш часто виявлялися бактерії, на долю яких припадало 78,1% (143): найчастіше стафілококи – 25,1% (46), також високі показники виділення встановлені для представників родини Enterobacteriaceae – 21,9% (40) та р. Streptococcus – 19,7% (28). Частота виявлення інших бактерійних збудників загалом становила 15,8% (29). У процесі проведення мікробіологічного аналізу були виявлені ізоляти досить рідких: у 6 (3,3%) випадках – Clostridium perfringens, у 2 (1,1%) – Mycobacterium tuberculosis та у 1 (0,5%) – Neisseria meningitidis. Збудники раневої анаеробної інфекції були ізольовані з гнійного ексудату травматичних ушкоджень пацієнтів терапії. Штами Mycobacterium. tuberculosis були виділені із мокротиння хворих терапевтичного відділення. Культуру Neisseria meningitidis виділено з крові пацієнта реанімаційного відділення.

Із урогенітального тракту 36 обстежених осіб гінекологічного та урологічного відділень лікарні було виділено умовно-патогенні клінічні ізоляти дріжджоподібних грибів р. Candida (19,7% випадків) і у чотирьох пацієнток гінекології – Trichomonas vaginalis (2,2%).

Як відмічено вище, переважну кількість зразків отримували з урогенітального тракту і в них мало місце виявлення всіх видів ідентифікованих збудників за винятком менінгококів та мікобактерій, тобто цей біотоп виявився найбільш сприятливим для колонізації різноманітними видами мікроорганізмів. Значну кількість збудників також було виділено з матеріалу зі шлунково-кишкового тракту, за винятком менінгококів, мікобактерій, мікоплазм і трихомонад. Видовий спектр мікроорганізмів, що інфікували шкіру і кров, виявився найменш різноманітним: з крові було виділено Neisseria meningitidis, а зі шкіри – представників родів Staphylococcus і Streptococcus. Верхні дихальні шляхи колонізували переважно представники грампозитивних коків, що належали до родів Staphylococcus і Streptococcus, також з цього біотопу виділяли Mycobacterium tuberculosis.

З огляду на переважно акушерсько-гінекологічний профіль лікарні, а отже, і переважання матеріалу з відповідних відділень, вказаний розподіл активності колонізації мікроорганізмами різних біотопів є найбільш вірогідним. Однак, не виключено, що при дослідженні більшої вибірки зразків з усіх відділень може відбутися перерозподіл долевого внеску різних біотопів.

Проведення видової ідентифікації стафілококів дозволило встановити їх приналежність до 4 видів (рис. 5.4): Staphylococcus aureus – 56,5% (26), Staphylococcus epidermidis – 26,1% (12), Staphylococcus saprophyticus – 15,2% (7) та Staphylococcus carnosus – 2,2% (1).

Рис. 5.4 Видовий спектр виділених штамів стафілококів

Аналіз матеріалів показав, що штами золотистого стафілокока виділяли переважно (по 10 випадків) з верхніх дихальних шляхів вагітних, які стояли на обліку у жіночій консультації, з виділень урогенітального тракту пацієнток гінекологічного відділення та в усіх 3 випадках ураження шлунково-кишкового тракту у відділенні новонароджених. Також клінічні варіанти Staphylococcus aureus було ізольовано із крові пацієнта з реанімації та з уражень шкіри у 2 осіб із терапевтичного відділення.

Клінічні ізоляти Staphylococcus epidermidis і Staphylococcus. saprophyticus виділяли переважно з урогенітального тракту пацієнток гінекологічного відділення та верхніх дихальних шляхів жінок, що стояли на обліку у жіночій консультації. Один штам Staphylococcus carnosus виділено з урогенітального тракту пацієнтки гінекологічного відділення при запаленні бартолінієвої залози.

Дослідження біологічних властивостей стафілококів проводили за стандартними ознаками. Визначали плазмокоагулазну активність, наявність гемолізинів, ліпази, лецитинази, розрідження желатини. (табл. 5.2).

Таблиця 5.2

Частота прояву факторів патогенності у виділених штамів стафілококів (n=46)

Вид	Виявлена активність, абс. / %
	Плазмо-коагулазна	Гемолітич-на	Ліпазна	Лецитіназ-на	Желати-назна
S. aureus	100	24/92,3	19/73,1	20/76,9	18/69,2
S. epidermidis	-	7/58,3	4/33,3	5/41,7	3/25,0
S. saprophyticus	-	3/42,9	3/42,9	2/28,6	2/28,6
S. carnosus	-	1/100	-	-	1/100

Отримані дані свідчать, що досліджені штами володіли значним ступенем прояву факторів патогенності. Так, всі штами S. aureus мали прояв плазмокоагулазної активностї. Понад 50% виділених культур продукували β-гемолізини, що викликали розпад еритроцитів на середовищі з утворенням зони гемолізу від 2 до 11 мм. У всіх випадках гемоліз був з повним просвітленням середовища.

Ліпазу та лецитіназу продукували переважно штами золотистого стафілокока (понад 73% штамів), а розрідження желатини було менш вираженим – до нього були здатні 24 штами (52,2%).

Ступінь активності плазмокоагулази виділених культур золотистого стафілокока показав як високий ( до 2 годин інкубації) для 45.7 % штамів S. аureus, середній ( до 8 годин інкубації) – для 43,5 %, низький ( до 4 годин інкубації) - для 10,8% штамів (табл. 5.3).

Таблиця 5.3

Показники активності плазмокоагулази досліжених культур S. aureus

Час інкубації	2 год	8 год	24 год
Кількість штамів (абс. / %)	21/45,7	20/43,5	5/10,8

Ступінь прояву коагулазної активності визначається часом згортання плазми і є кількісним показником здатності клітин досліджуваної культури стафілококу продукувати цей фермент агресії. Отже, можна заключити, що більшість штамів володіла значним патогенним потенціалом, що посилює їх колонізаційну активність і підвищує ризик розвитку інфекційних уражень у осіб, від яких вони виділені.

При значній активності прояву патогенетичних властивостей збудників показано необхідність лікування інфікованих осіб. Це можливе при застосуванні антибіотиків, однак, для ефективного видалення стафілококів слід обов’язково досліджувати їх чутливість до лікувальних препаратів перед їх призначенням [1, 4].

Для проведення антибіотикограми було використано диски з пеніциліном, метіциліном, меропенемом, тетрацикліном, цефтріаксоном та гентаміцином, що регламентується наказом №167 МОЗ України як антибіотики першої черги для лікування стафілококових уражень. [8]

В результаті дослідження було встановлено, що більшість виділених штамів мали стійкість до 2-3 препаратів з перелічених (рис. 5.5). Важливо відмітити, що серед штамів золотистого стафілококу метіцилінрезистентних виявлено не було.

Визначено, що найбільш ефективним був препарат меропенем і з класу карбопенемів, чутливим до якого були понад 92% досліджених штамів, виділених з верхніх дихальних шляхів та зі шкіри. Також високу ефективність показано для цефтріаксона, чутливими до якого виявилися понад 73% штамів. Низьку антибактеріальну активність виявлено у пеніциліна – до нього чутливими були не більше 28% штамів і тетрацикліна – не більше 66% чутливих ізолятів. Представник виду S. carnosus виявився взагалі стійким до цих препаратів.

Рис. 5.5 Чутливість до антибіотиків виділених штамів стафілококів

Проведення порівняльного аналізу частоти зустрічаємості стійких до антибіотиків штамів стафілококів різних видів показало, що серед ізолятів S. aureus частіше виявлялись резистентні варіанти до пеніциліну – 89,1%, цефтріаксону – 26,9%, гентаміцину – 30,8%. Культури S. epidermidis проявляли стійкість до антибіотиків у меншому ступені: до пеніциліну – 83,3%, до тетрацикліну – 33,3% та до гентаміцину – 25%. Найменше резистентних варіантів було виявлено серед представників виду S. saprophyticus: до пеніциліну стійких було 71,4% ізолятів, до тетрацикліну – 57,1%, до гентаміцину – 14,3%. Перелік препаратів для протибактеріальної терапії стафілококових інфекцій переважно включає β-лактамні антибіотики, цефалоспорини, макроліди та аміноглікозиди; значно рідше використовуються тетрацикліни, глікопептиди, фторхінолони та лінкозаміди [4, 5]. Одержані результати свідчать, що застосування пеніцилінів недоцільно, а препаратами вибору можуть бути цефалоспорини та карбопенеми. На наступному етапі було доцільним провести порівняльний аналіз результатів поточного дослідження з ретроспективними даними за 2014р. показав, що серед мікроорганізмів, виділених з 811 зразків біологічного матеріалу з різних відділень, стафілококи становили абсолютну більшість від виділених збудників уражень дихальних шляхів і це погоджується із даними, отриманими у поточному дослідженні. Так, їх загальна частка становила 47%. Найбільш часто виділяли штами S. aureus – 39% випадків, значно рідше – S. epidermidis та S. saprophyticus – 6% та 2% відповідно.

Високою також була частота виявлення представників р. Streptococcus – 33%. Інші мікроорганзіми виявлялися зі значно меншою частотою. Сумарна їх частка становила 18%, з них переважали види родини Enterobacteriaceae – 10% та дріжджі роду Candida – 4%. З представників ентеробактерій виявляли: Klebsiella spp. – 6%, E. coli – 3% та Enterobacter spp. – 1%.

Рис. 5.6 Частота виявлення різних груп мікроорганізмів у 2014 р.

Серед інших бактерій, частка яких становила 2%, виділяли у одиничних випадках Haemophilus influenzae (3 випадки), Neisseria gonorrhoeae (2 випадки), Mycobacterium tuberculosis (1 випадок). У 2% випадків бактеріологічними методами збудника взагалі виявлено не було.

Для всіх виділених штамів стафілококів здійснювали вивчення прояву факторів патогенності: плазмокоагулази, ліпази, лецитінази та гемолітичних властивостей (табл. 5.4).

Таблиця 5.4

Частота прояву факторів патогенності у виділених штамів стафілококів (n=169)

Ознака	Плазмокоагулаза	Гемоліз	Ліпаза	Лецитіназа
Частота виявлення, %	82,8	88,2	82,8	84,6

Примітка: плазмокоагулазу досліджували тільки для штамів S. aureus

Плазмокоагулазу продукували всі виділені штами золотистого стафілокока. Здатними до гемолізу були 88,2% штамів, з них β-гемоліз давали 63,8% штамів, а α-гемоліз – 36,2%. Ліпазну та лецитіназну активності одночасно проявляли 80,4% штамів, окремо продукували ліпазу 2,4% штамів. а лецитіназу – 4,2% штамів. Отриманні значення вказують на високий ступінь поширення патогенних штамів, що потребувало обов’язкового лікування. Для вибору оптимальної схеми терапії здійснювали вивчення чутливості до антибіотиків виділених культур (рис. 5.7).

Встановлено, що знижену ефективність мали азитроміцин, гентаміцин та тетрациклін – чутливі не більше 72,1%. Натомість чутливість до інших застосованих препаратів була високою – понад 75%. Найбільш ефективними були меропенем – 97,1% штамів чутливі, та метіцилін – 92,9% чутливі. Для коагулазонегативних стафілококів високоефкективним виявився також гатіфлоксацин – чутливі понад 91%.

Рис. 5.7 Стійкість до антибіотиків виділених у 2014 р. штамів стафілококів

Отримані результати аналізу практично погоджуються з відомими даними [2, 5] багатоцентрових досліджень. Так, показано, що штами стафілокока чутливі до рифампіцину – 88,7% випадків, до карбапенемів – понад 95% випадків, до азитроміцину – 69,8%, до ципрофлоксацину – 64,1%, до доксицикліну – 62,3%, до ванкоміцину – 75,5%, до пеніциліну – 69,8%, до кліндаміцину – 56,6%, до цефтазидиму – 52,8%. Водночас, слід наголосити, що наведені дані є усередненими і типовими для певних стаціонарів і регіонів, а тому кожен конкретний випадок потребує здійснення антибіотикограми для обирання раціональної схеми терапії. З огляду на профіль лікарні (основними відділеннями вважаються гінекологія, жіноча консультація та пологове) препаратами вибору для лікування стафілококових інфекцій звичайно є бета-лактамні антибіотики та цефалоспорини, які вважаються одними з найбільш безпечних, у тому числі і при застосуванні під час вагітності[3].

Література

1.Белоусов Ю.Б. Устойчивость клинических штаммов коагулазоотрицательных стафилококков / Ю.Б. Белоусов, С.М. Шатунов // Клин. фармакология и терапия. – 2004. – № 3. – С. 58-61.

2. Гуткин А.Б. Устойчивость клинических изолятов стафилококков к антибиотикам группы аминогликозидов / А.Б. Гуткин, Ю.Б. Белоусов // Клин. фармакол. и терапия. – 2004. – №3. – С. 47-49.

3. Дворецкий Л.И. Дифференцированное применение цефалоспоринов в лечении инфекций верхних и нижних дыхательных путей / Л.И. Дворецкий, В.В. Омельяновский // КМАХ. – 2008. – №6. – С. 24-28.

4. Зубов Л.А. Современные проблемы антибиотикорезистентности в педиатрической клинике / Л.А. Зубов, Ю.Н. Богданов // Антибиотики и химиотерапия. – 2008. – № 4. – С. 43-49.

5. Макушенко P.C. Видовий склад та чутливість до антибіотиків оксацилінрезистентних штамів стафілококів / P.C. Макушенко, Л.В. Авдєєва, Я.Ю. Мачерет // AML. – 2008. – № 1-2. – С. 14-19.

6. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений: приказ № 535. – [чинний від 22.04.1985р.]. – М.: МОЗ СССР, 1985. – 65с.

7. Покровский В.И. Внутрибольничные инфекции: проблемы и пути решения / В.И. Покровский, Н.А. Семина // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2010. – № 5. – С. 12-14.

8. Про затвердження методичних вказівок щодо визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів: Наказ МОЗ України № 167 чинний від 05.04.2007р. – К: МОЗ України, 2007. – 63 с.

9. Соколова І.Є. Виготовлення та застосування імунобіологічних препаратів / І.Є. Соколова. – Дніпропетровськ: Середняк Т.К., 2014. – 173 с.