Линник А.И.

ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»

Влияние технологических параметров культивирования на активность фермента кератиназы

До недавнего времени процесс культивирования микроорганизмов считался довольно простым процессом, проходящим через ряд общих стадий и приводящим в конечном итоге к получению из малого количества посевного материала необходимый объем биомассы или продуктов метаболизма. Однако с развитием и распространением биотехнологических методов процесс культивирования стал индивидуальнее для каждого вида микроорганизмов. Правильно подобранные технологические параметры являются залогами успеха. К числу технологических факторов, оказывающих воздействие на микроорганизмы, относятся температура, состав питательной среды, рН. В зависимости от варьирования технологических параметров можно достичь высокой скорости роста микроорганизмов и наработку метаболитов.

В настоящее время в связи с интенсивным развитием биотехнологических методов, как наиболее экологичных и экономически выгодных из существующих на сегодняшний день, перспективным представляется использование их для переработки отходов производства в пищевые и кормовые продукты, с целью создания замкнутых циклов производства. Переработка отходов на сегодняшний день является главным экономическим вопросом, а также основным предметом в обсуждениях проблемы защиты окружающей среды.

Нами был получен штамм микроорганизмов, который продуцирует фермент, влияющий на структуру кератина для переработки кератинсодержащих отходов.

Основной целью исследования была оптимизация параметров культивирования микроорганизмов для получения максимального выхода фермента обладающего высокой активностью.

Температура – это один из важнейших факторов культивирования микроорганизмов. Она может, как ускорить прирост биомассы за счет продуцирования белка, так и снизить. Выбор оптимума температуры позволяет с высокой эффективностью проводить накопление необходимого продукта.

Для определения оптимальных температурных параметров и их влияния на активность микроорганизмов проводили спектрофотометрическое исследование. Выбранные для исследования температурные параметры составили диапазон от 30 до 50°С. Культивирование проводили в течение 12 ч. После завершения культивирования микроорганизмов проверяли активность фермента до и после разрушения клеточной стенки с помощью ультразвука.

В результате анализа данных, можно сделать вывод о том, что при температуре 50°С активность накопленного микроорганизмами фермента составляет 28,47 е/мг, что является максимумом для данного штамма, а при 45 °С его активность падает, и составляет 14,05 е/мг. Сравнение показателей активности при температуре 50°С с разрушением клеточной стенки и без разрушения, показало, что единицы активности различаются всего на 0,38 е/мг. Данный факт связан с тем, что фермент продуцируется микроорганизмами во внешнюю среду и не накапливается в больших количествах внутри клетки.

Концентрация ионов в среде также имеет большое влияние на процесс роста, поскольку именно этот параметр определяет проницаемость оболочки микроорганизмов, вследствие чего питательные вещества усваиваются клетками с разной скоростью.

В эксперименте изучались параметры роста микроорганизмов при рН с 5,0 до 12,0 с шагом 1,0. Было установлено, что оптимальным диапазоном рН среды для культивирования является 7,0-8,0. В данном диапазоне происходит максимальная активация фермента и его накопление в культуральной жидкости, тогда как рН 10,0-12,0 блокирует проницаемость стенки, соответственно замедляя развитие микроорганизмов и продуцирование фермента усложняется. Несмотря на это, показатели активности фермента снижаются равномерно без инактивации роста, что в свою очередь демонстрирует возможность культивирования данного штамма в широком диапазоне рН.

В процессе глубинного культивирования микроорганизмов важным параметром является перемешивание культуральной жидкости, способствующее выравниванию растворенных компонентов питающего субстрата, кислорода и продуктов метаболизма по всему объему аппарата.

Определение частоты оптимального перемешивания культуральной жидкости с микроорганизмами происходило при трех скоростях, которые составили 50, 100, 150 об/мин. На рисунке 1 представлены данные зависимости активности фермента, прироста биомассы и степени пенообразования от скорости перемешивания.

Рисунок 1. – Зависимость изменения активность фермента от скорости перемешивания при культивировании

Данные представленные на рисунке 1 свидетельствуют о том, что культура адекватно реагирует на различные условия перемешивания питательной среды. На основе полученной информации, можно сделать вывод о том, что при скорости перемешивания 100 об/мин накопленный микроорганизмами фермент наиболее активен, при этом прирост биомассы идет равномерно во всем объеме питательной среды. При 150 об/мин его активность падает до 12,89 е/мг, помимо этого происходит стойкое интенсивное пенообразование. Данный факт, очевидно, связан с необратимыми механическими повреждениями клеток культуры. При 50 об/мин происходит хорошее накопление биомассы и активность фермента составляют 14,12 е/мг. Однако в процессе культивирования происходит плотное налипание биомассы на стенки сосуда и микроорганизм развиваются не равномерно. Можно сделать вывод о том, что оптимальный диапазон скорости перемешивания для микроорганизма составляет от 50 до 100 об/ мин.

Правильный подбор оптимальных условий культивирования микроорганизмов позволяет без генетических модификаций штамма получать на выходе большие объемы высокоактивного ферментного препарата. Дальнейшие исследования были направлены на подбор оптимального состава питательной среды, который позволил бы получить максимальную скорость накопления ферментного препарата в культуральной жидкости с минимальными сроками культивирования.

Литература

1. Патент РФ № 2279440, МПК C07K5/062. Способ получения l-аланил-l-глутамина / Ёкозеки К., Сузуки С. - 2003137001/13; заявл. 26.07.2002; опубл. 10.07.2006.

2. Переработка вторичного кератинсодержащего сырья и получение белковых гидролизатов на пищевые и кормовые цели / А.И. Морозова, О.О. Бабич, А.Ю. Полетаев и др.// Техника и технология пищевых производств.- Кемерово, 2011. - №2 (21). – С. 7- 11.

3. Уайт, В.М. Технология чистых помещений. Основы проектирования, испытаний и эксплуатации / В.М. Уайт. - М.: Клинрум, 2002. - 301 с.