Рис является основным продуктом питания для половины населения мира и занимает второе место среди зерновых культур по объемам мирового производства после пшеницы, его выращивания датируется около 7000 лет назад в Юго-Восточной Азии []

Сельское хозяйство/4.Технологии хранения и переработки сельскохозяйственной продукции.

* Dr.sci.tech. Kolpakova V. V., ** dr Chumikina L.V. ** dr Arabova L.I.

* Moscow State University of Food Production, Russia

** A.N. Bach Institute of Biochemistry Russian Academy of Sciences

USE OF ENZYMES FOR ALLOCATION OF PROTEINS FROM THE RICE FLOUR

Summary. In work results of research of process of receiving proteins from white and red rice with application of fermentation preparations of amilase and ksilanase action are presented. Optimum conditions of extraction of rice proteins in hydrochloric acid are established, influence of processing of rice flour with enzyme preparations on an exit of proteins by sedimentation in isoelectrical point with salt use is studied.

KEYWORDS: RICE FLOUR, PROTEINS, ENZYMES, CONCENTRATE, EXIT.

*Д.т.н. Колпакова В.В., **к.б.н. Чумикина Л.В., **к.б.н. Арабова Л.И.

*Московский государственный университет пищевых производств, Россия

**Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Россия

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ РИСОВОЙ МУКИ

Резюме. В работе представлены результаты исследования процесса получения белков из белозерного и краснозерного риса с применением ферментных препаратов амилазного и ксиланазного действия. Установлены оптимальные условия экстрагирования рисовых белков в соляной кислоте, изучено влияние обработки рисовой муки ферментными препаратами на выход белков с осаждением в изоэлектрической точке с использованием соли.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: РИСОВАЯ МУКА, БЕЛКИ, ФЕРМЕНТЫ, концентрат, ВЫХОД.

Общепризнанным путем ликвидации дефицита белка и устранения его качественной неполноценности является использование растительных источников с комплементарным аминокислотным составом [1]. Одной из наиболее ценных и распространенных в мире продовольственных культур является рис, занимающий второе место по объемам производства после кукурузы, а по валовым сборам - после пшеницы [2]. По количеству белков (среднее содержание 8%) он уступает другим зерновым культурам [3-5], но по сравнению с белками других хлебных злаков, рис обладает относительно высокой питательной ценностью и сравнительно хорошо сбалансированным аминокислотным составом за счет присутствия гистидина, лейцина, триптофана, валина, лизина [6, 7]. Besides this, one of the most important reasons for the popularity of rice proteins is the fact that they are natural food crops.

В зависимости от сорта и условий произрастания соотношение альбумины: глобулины: проламины: глютелины колеблется от 1:12:5:81 до 2:4:2:92, что означает, что рис от других культур отличается пониженным содержанием проламинов[8-10] и это характеризует его как гипоаллергенный компонент продуктов питания [8, 11]. В силу высокой питательности и хороших органолептических характеристик (мягкий вкус, белый цвет) концентраты и изолированные белки из риса являются конкурентоспособным ингредиентами в медицине, косметологии, диетических продуктах питания (напитки, йогурты, каши и т.д.) [8, 11, 12].

Известны методы выделения и модификации различных компонентов переработки зерна риса с применением гидролитических ферментных препаратов (ФП)products.. Так, Моritа и Kiriyama [13] солюбилизировали рисовую flour with á -amylase to prepare a protein-rich product with >90%муку под действием α-амилазы и выделили препарат с содержанием белка около 90%protein.. Using rice flour obtained at 70–35% milling, the treat-рММука обрабатывалась ФП ment was conducted at 97°C for 2 hr, and the product was obtained2 ч при 97°С, продукт отфильтровывался и отделялся от растворимых веществ кипящей водой. Белок частично денатурировался, функциональные свойства и выход были не достаточно высокие. Similar enzymaticИзвестен также способ переработки рисовой муки с комплексными энзимными препаратами карбогидраз [11, 14]. МThe products were characterized by chemical, physical, and func-ука обрабатывалась α-амлазой, глюкоамилазой, гемицеллюлазой, после чего отделялась от растворимых веществ, оставшийся продукт принимался за концентрат с содержанием белка до 76% от общей его массы. В целом же, в литературе недостаточно информации о способах получения белков из различных вида риса, позволяющих максимально экстрагировать биополимеры и с хорошими функциональными свойствами. В тоже время эффективное извлечение белков и регулирование их свойств в направлении улучшения, могли бы There is a need to study and improve the quality and quantityиметь существенное значение для промышленного производства и использования их в пищевых продуктах.

Задачей данной работы явилось сравнительное исследование растворимости и выхода белков из белозерного и краснозерного коричневого риса с применением ферментов, гидролизующих полисахариды зерна с целью разработки технологической схемы выделения концентратов с хорошими функциональными свойствами.

MATERIALS AND METHODSМатериалы и методы

Использовали муку 1 сорта, произведенную из длиннозерного риса сорта «Гао там» компанией Хай Иен (Вьетнам), и муку из краснозерного вьетнамского риса «Тхай Зыонг» с коричневым оттенком (выход 78%).

Для экстракции белков применяли уксусную (ГОСТ 61-75), соляную (ГОСТ 3118-77) кислоты, хлорид натрия (ГОСТ 13830-97), этанол (ГОСТ 18300-72), гидроксид натрия (ГОСТ 2263-79), трехзамещенный цитрат кальция (Е 333) с содержанием основного вещества 99,9%. Использовали ФП фирмы Новозаймс: Фунгамил 2500 (эндоамилаза) с амилолитической способностью (АС) 2500 ед./г, гидролизующую α - 1,4 связи (рН 5,5-6,0, температура 65-70 °С), Шеарзим 500 Л с грибной ксиланазной активностью (ГКА) 500 ед./г (рН 4,5-5,5, температура 60-70°С) и комплексный препарат Фунгамил Супер AX с активностью АС/г 2500 ед. и ГКА - 500 ед./г (рН 4,5-5,5, температура 55-60°С).

Массовую долю белка в муке определяли методом Кьельдаля [15], массовую долю жира – в аппарате Сокслета с гексаном [16], зольность - ускоренным методом [15], содержание крахмала и восстанавливающих сахаров - методом Бертрана [15, 17], клетчатки - по Кюршнеру и Ганеку [15]. Количество гемицеллюлоз определяли с гидролизом 2%-ной соляной кислотой и определением сахаров по методу Бертрана [15].

Для определения фракционного состава белков муку обезжиривали экстракцией гексаном на холоду. После чего в течение 2 ч при 160 об/мин и температуре 25^оС муку дважды последовательно встряхивали с дистиллированной водой, 5% - ным раствором хлорида натрия, 70% - ным раствором этанола и 0,02 M раствором едкого натра, переводя в раствор тем самым, соответственно, альбумины, глобулины, проламины, глютелины. Сtimes in order to remove all the protein of each fraction.Суспензию муки центрифугировали 15 минут при 7000 об/мин, два супернатанта с каждым растворителем объединяли и определяли в них содержание белка. Перед экстрагированием проламинов остаток муки дважды промывали холодной (4^оС) дистиллированной водой для удаления следов соли.

Результаты и их обсуждение

Первоначально исследован химический состав рисовой муки из белозерного и краснозерного коричневого зерна (табл. 1). Установлено, что основная доля в

Таблица 1 - Химический состав рисовой муки

Показатели химического состава	Массовая доля, г/100 г муки
Показатели химического состава	белозерный рис	краснозерный рис
Влага	12,00	12,70
Белок	9,08	14,16
Жир	0,90	0,60
Крахмал	70,20	64,00
Восстанавливающие сахара	0,11	0,20
Клетчатка	0,60	0,30
Гемицеллюлозы	6,00	6,44
Зола	0,80	1,60

муке приходилась на крахмал, меньшее количество - на белок и гемицеллюлозы, что в целом соответствует литературным данным [19-21]. В муке из коричневого риса в 1,56 раза больше содержалось белковых веществ, в 2 раза больше зольных элементов, по сравнению с мукой из белозерного сорта.

Растворимость белков для белозерного риса составляла 99,68 % от их общего количества и 99,1% - для краснозерного риса (табл. 2).The

Таблица 2 - Фракционный состав белков рисовой муки

Фракции белков	Массовая доля фракций, % от общего количества белков
Фракции белков	белозерный рис	краснозерный рис
Альбумины	4,10	6,15
Глобулины	12,60	14,15
Проламины	3,58	6,00
Глютелины	79,64	72,8

Видно, что основная масса белков представлена глютелинами, на втором месте находились альбумины, глобулины и меньше количество белка приходилось на спирторастворимую фракцию. Мука из краснозерного риса содержала на 6,1 %total protein contained 4.5% albumin, 13.1% globulin,

больше альбуминов, глобулинов, проламинов и меньше белков глютелиновой фракции.

Лучше всего белки зерновых культур растворялись в щелочи, которая их денатурируют [22], тогда как кислоты являются более щадящими реагентами, поэтому далее нами изучена растворимость белков риса в соляной и уксусной кислоте для выделения их в виде препаратов и изучения функциональных свойств.

Установлено, что чем выше концентрация растворов кислот, тем растворимость белков выше. Так, в растворах уксусной кислоты растворимость составляла 10,1 – до 20,2%, в растворах соляной кислоты – 40 до 59%, что можно объяснить большей степенью диссоциации второй кислоты (рКа 0,8), по сравнению с первой (рКа 4,76).

Таблица 3 – Влияние концентрации кислот на растворимость белков муки

№ п/п	Нормальность кислоты	Растворимость белка, % от общей массы
№ п/п	Нормальность кислоты	Соляная кислота	Уксусная кислота
1	0,0050	40,30±0,8	10,10±0,7
2	0,0075	56,20±1,0	16,20±0,6
3	0,0100	59,00±1,0	20,20±1,2
4	0,0250	58,00±1,1	20,18±1,2

При сравнении растворимости белков с фракционным составом (табл. 2, табл. 3) видно, что наряду с альбуминами, глобулинами и проламинами в состав рисовой муки входит и так называемый «растворимый» в 01н растворе соляной кислоты глютелин в количестве от 20 до 39%, тогда как 40-42% от общего количества белков представлено нерастворимым глютенином.

С учетом того, что в рисовой муке содержится крахмал и гемицеллюлозы, которые находятся во взаимодействии с белками, то далее ставилась задача повышения растворимости полимеров и перехода их в раствор за счет использования гидролитических ферментов (амилазы, ксиланазы), катализирующих в полисахаридах разрыв гликозидных связей и облегчающих, тем самым, доступ растворителей к белкам. С этой целью исследованы различные схемы обработки рисовой муки ферментными препаратами. Контролем служил образец, обработанный 0,01н раствором соляной кислоты.

В соответствии с I схемой, перед экстрагированием соляной кислотой муку обрабатывали ФП Фунгамилом 2500 при гидромодуле 1:07, рН 5,8-6,0, температуре 70⁰ С, концентрации 0,1% к массе сырья и времени – 90 мин. По II схеме после обработки Шеарзимом 500 Л в течение 2 ч при дозе 60 ед /г сырья, гидромодуле 1:06, температуре 70 ⁰ С и рН=4,8 белки экстрагировали 0,01н раствором соляной кислоты.

По III схеме мука обрабатывалась последовательно ФП Фунгамилом 2500, Шеарзимом 500 Л при вышеуказанных режимах, после чего белки экстрагировались соляной кислотой при тех же параметрах. Последняя IV схема включала обработку ФП Фунгамил Супер AX, содержащих амилазу и ксиланазу при концентрации 60 ед /г в течение 2 ч и оптимальных условиях: рН - 4,8, температура – 60°С.

Из табл. 4 видно, что в присутствии Фунгамила 2500 растворимость белков повышалась на 6%, по сравнению с контролем; с Шеарзим 500 Л растворимость увеличивалась на 21%; при совместном действии его с Фунгамилом 2500 и с

Таблица 4 – Выход белков муки с ФП, % от общего количества в сырье

Способ обработки рисовой муки	Растворимость белка, % от общего количества
Раствор соляной кислоты, 0,01н (контроль)	59 ± 1
Фунгамил 2500 + 0,01н HCl	65 ± 1
Шеарзим 500 Л + 0,01н HCl	80 ± 2
Фунгамил 2500 + Шеарзим 500 Л + 0,01н HCl	92 ± 1
Фунгамил Супер AX+ 0,01н HCl	92 ± 2

препаратом Фунгамил Супер AX, содержащим одновременно амилазу и ксиланазу, - на 34%. В итоге общий выход белков в растворе после обработки сырья по двум последним схемам составил 91-94%, от общего его количества в сырье.

Осаждением белков при различных значениях рН установлена изоэлектрическая точка, равная 7,4. Экстракт выдерживали 30 минут при 4⁰ С, после чего раствор центрифугировали при 7000 об./мин 15 минут и измеряли вес осадка. Выход осажденного белка составил 91-92% от общего количества в растворе и 84-85 % от общей массы его в сырье.

Комбинированным осаждением белков в изоэлектрической точке (pH 7,4) с одновременным воздействием 2% цитрата кальция установлено, что выход белков может достигать 96% от общего количества в растворе, что составляет 88 % от общего количества его в сырье.

Аналогичные исследования с применением ФП Фунгамил 2500, Шеарзим 500 Л и Фунгамил Супер AX проведены для муки, полученной из коричневого риса. Установлено, что значения растворимости и выхода белков отличались от соответствующих значений для белозерного риса и составляли только 64 и 59%, от общего количества их в сырье, соответственно. При этом замечено, что меньшее количество глютенинов в муке из краснозерного риса (72,8%) соотносилось с меньшим выходом его белков (59%). Вероятно, что отличия в выходе белков нельзя объяснить только различиями во фракционном составе, возможно, что и красящие вещества риса, находясь во взаимодействии с биополимерами, затрудняли переход их в раствор и понижали выход белка.

Выводы

1. Химический состав муки из краснозерного риса характеризуется в 1,5 раза большим содержанием белка, в 2 раза большим количеством зольных элементов, и, соответственно, меньшим - крахмала (на 9,6%) и жира (в 2 раза), чем состав муки из белозерного риса;

2. В состав белков белозерного риса, наряду с альбуминами, глобулинами, проламинами и общим глютенином, входит «растворимый» в кислотах глютенин в количестве 20-39% от общего количества белков в муке;

3. С применением ферментов амилаз и ксиланаз растворимость белков рисовой муки в растворах 0,01н соляной кислоты повышается до 90-92% от общего количества их в сырье;

4. При осаждении в изоэлектрической точке (рН 7,4) с добавлением трехзамещенного цитрата кальция выход белков достигает 91-92 % от общего количества в растворе и 88-89% от общей массы в сырье для рисовой муки из белозерного риса и64 и 59%, соответственно, для муки из краснозерного риса.

Литература

1.Колпакова В.В., Ванин С.В. Функциональные свойства белковых препаратов и композитов из растительного сырья. Учебное пособие – М.: МГУПП, 2008. – 61 с.

2. Колпакова В.В., Нечаев А.П. Химия пищевого белка: Учебное пособие. – М.: МГУПП, 2003. – 88с.

3. Takane Matsuo, Masaharu Shimizu, Shigesaburo Tsunoda, Yoshio Murata, Kikuo. Kumazawa, Yuzo Futsuhara, Kiyochika Hoshikawa, Eizo Maeda, Kou Yamazaki . Science of the Rice Plant (Vol. 2). Morphology, Rural Culture Association, Tokyo. 1995. – 1246 c.

4. Скурихин И.М., Волгарев М.Н. Химический состав пищевых продуктов. Кн. 1: Химический состав пищевых продуктов – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Агропромиздат, 1987. – 213 с.

5. M.P.C. Silvestre, C.R. Vieira, M.R. Silva, R.L. Carreira, V.D.M. Silva, H.A.Morais. Protein extraction and preparation of protein hydrolysates from rice with low phenylalanine content // Asian J. Sci. Res – 2009. -№2. – Р. 146-154.

6. Хосни Р. К. Зерно и зернопродукты. — СПб.: Профессия, 2006. - 336 с.

7. Okuzaki, M., M. Negishi and Y. Sugahara. Protein contents and amino acid scores of protein in Japanese paddy non-glutinous rices // Food Sci. Technol. – 1997. - № 44. – Р. 659-665.

8. Ju ZY., N.S. Hettiarachchy, and N. Rath. Extraction denaturation and hydrophobic properties of rice flour proteins //Journal of Food Science. – 2001. - № 66. - P. 229-232.

9. Tecson, E.M.S., B.V. Esmana, L.P. Lontok and B.O. Juliano. Studies on the extraction and composition of rice endosperm: glutelin and prolamine // Cereal Chem. –1971. № 48. – Р. 186-191.

10.Козьмина Е.П. Рис (хранение и переработка). М.: Хлебоиздат, 1975. - c. 128.

11.Shih Frederick & Daigle Kim. Use of enzymes for the separation of protein from rice flour // Cereal Chem. – 1997. - № 74. – Р. 437-441.

12. Hansen, L. P., Hosek, R., Callan, M., and Jones, F. T.. The development of high-protein rice flour for early childhood feeding // Food Technol. -1981. - № 35. - P.38-42.

13. Morita, T., and Kiriyama, S. Mass production method for rice protein isolate and nutritional evaluation // J. Food Sci. № 58. - 1993. – Р. 1393-1396.

14. Shih, F.F and K.W. Daigle. 2000. Preparation and characterization of rice protein isolates //Journal of the American Oil Chemists’ Society. – 2000. - № 77. – Р. 885-889.

15. Ермаков А.И., Арасимович В.Е., Смирнова-Иконникова М.И., Ярош Н.П., Луковникова Г.А. Методы биохимического исследования растений. Л.: Колос. - 1972. - 456 с.

16.Шапиро Д. К. Пратикум по биологической химии. Минск: Выш. школа, 1976. - 287 с.

17. Плешков Б. П. Практикум по биохимии растений. - М.: Колос, 1985. - 255с.

19. Takane Matsuo, Masaharu Shimizu, Shigesaburo Tsunoda, Yoshio Murata, Kikuo. Kumazawa, Yuzo Futsuhara, Kiyochika Hoshikawa, Eizo Maeda, Kou Yamazaki. Science of the Rice Plant (Vol. 2) . Morphology, Rural Culture Association, Tokyo. 1995. – 1246 c.

20. Скурихин И.М., Волгарев М.Н. Химический состав пищевых продуктов. Кн. 1: Химический состав пищевых продуктов – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Агропромиздат, 1987. – 213 с.

21. M.P.C. Silvestre, C.R. Vieira, M.R. Silva, R.L. Carreira, V.D.M. Silva, H.A.Morais. Protein extraction and preparation of protein hydrolysates from rice with low phenylalanine content // Asian J. Sci. Res – 2009. - №2. – Р. 146 -154.

22. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др. Пищевая химия. СПб.: ГИОРД, 2012. – 680 с.