А.Е. Есенбаева, О.А.Тен, Д.С. Балпанов

Филиал РГП «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан», КН МОН РК в г. Степногорск, е-mail: ipbncbrk@mail.ru

Выделение штамма бактерий Bacillus subtilis S-2, обладающего фунгицидной активностью

В последние годы в связи с бурным развитием биотехнологии и задачами обеспечения экологических условий жизни и производства усиливается интерес к спорообразующим бактериям. Главными объектами фундаментальных и прикладных исследований на протяжении многих лет были бактерии Bacillus subtilis, штаммы которого используются как продуценты ферментов и как пробиотики.

Устойчивость растений к заболеваниям, вызываемым почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами. Совокупность корневой системы с почвой представляет собой сложную экологическую нишу, заселенную полезными, вредными и нейтральными для растений микроорганизмами.

Широкое распространение заболеваний зерновых культур, вызываемых фитопатогенными грибами, наносит значительный экономический ущерб сельскому хозяйству. Развитие грибных болезней приводит к снижению урожая, а также к загрязнению зерна высокотоксичными веществами — микотоксинами, что значительно ухудшает потребительские качества зерна, его полноценность и безопасность для теплокровных. К наиболее опасным грибным болезням зерновых культур относятся фузариозы, возбудителями которых являются грибы рода Fusarium — Fusarium graminearum, Fusarium nivalae, Fusarium avenaceum, а также грибы рода Helmintosporium sp., Verticillium sp. Потери урожая от фузариоза достигают 30%. Источники инфекции при корневых гнилях — зараженные почва, семена, растительные остатки. В настоящее время для борьбы с корневыми гнилями преимущественно используются химические антимикотические препараты. При этом возникает ряд рисков, например, формирование устойчивости целевых микроорганизмов, токсичное воздействие на культурные растения, снижение активности микроорганизмов ризосферы.

Микроорганизмы, вносимые в почву в составе комплексных удобрений и удобрений на основе монокультур, способствуют повышению биологической активности почвы; оздоровлению почвы от фитопатогенов; активизации микробно-растительного взаимодействия; получению высоких урожаев экологически чистой сельскохозяйственной продукции; восстановлению микробиоценоза почв, нарушенного вследствие антропогенного воздействия [1]. Спорообразующие бактерии рода Bacillus наиболее перспективны в качестве компонентов биоудобрений, поскольку сохраняют жизнеспособность и устойчивость к повреждающим воздействиям. Среди представителей Bacillus sp только малая часть видов является патогенами и токсикогенами (Bacillus anthrachis, B.cereus и некоторые другие) [2,3,4].

Bacillus subtilis обладает антагонистической активностью, подавляя рост патогенных, условно патогенных грибов и бактерий и является важным продуцентом некоторых полисахаридов, протеаз, амилаз и аминокислот. Также является продуцентом полипептидных антибиотиков. Ввиду наличия антагонистических свойств против фитопатогенов используется в биозащите растений.

Перспективной, таким образом, является разработка биологического удобрения на основе органических компонентов и почвенных микроорганизмов, в том числе фитопатогенных бактерий.

Материалы и методы

Выделение фунгицидных микроорганизмов проводили из ризосферы растений. Отобранные образцы суспендировали в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:100 и встряхивали на инкубаторе-шейкере в течение 2 часов. Половину каждого образца прогревали при 80°С в течение 30 минут для удаления вегетативной микрофлоры.

На чашки Петри с питательной средой Чапека высевали тест-организмы–фитопатогенные грибки Fusarium sp, Helmintosporium sp, Verticillium sp, каждый организм на отдельную чашку. Чашки подсушивали при комнатной температуре 2 часа. Стерильной микробиологической петлей раскладывали капли суспензии на поверхности питательной среды (по 5-7 капель на 1 чашку). Чашки Петри с посевами инкубировали при комнатной температуре в течение 10 суток. После окончания инкубирования отбирали группы колоний, вокруг которых произошла задержка роста тест-организма. Подобные колонии образовались только вокруг капель суспензии, отобранной из прогретых проб почвы. Из отобранных образцов готовили суспензию и проводили высев разведений суспензии 10^-7-10^-8 на питательную среду Чапека, предварительно засеянную тест-организмами. Для дальнейшей работы выбирали колонии, вокруг которых формировались зоны задержки роста тест-организмов.

Отобранные колонии пересевали на скошенную среду Чапека, культивировали в термостате для образования биомассы в течение 3-5 суток. После образования биомассы отобранные моноизоляты тестировали на фунгицидную активность. Выделение и поддержание выделенных культур осуществляли на универсальных агаризованных средах. Для приготовления питательных сред пользовались приведенными ниже прописями.

Состав среды Чапека (г/л): сахароза - 30 г, NaNO₃ - 3 г, KH₂PO₄ - 1 г, MgSO₄ *, 7H₂О - 0.5 г, KCl - 0.5 г, FeSO₄×7H₂O - 0.01 г, агар-агар 15 г.

Результаты и обсуждение

Выделение микроорганизмов, обладающих фунгицидной активностью проводили из окультуренной каштановой почвы и слоя почвы прикорневой зоны овощных культур (картофеля, огурца). Отобранные в полевых условиях образцы помещали в стерильные пластиковые пакеты и в течении двух часов доставляли в лабораторию. Накопительную культуру ставили по описанной выше методике.

После образования биомассы, отобранные моноизоляты тестировали на фунгицидную активность методом агаровых блочков [4]. Результаты исследования отобранных моноизолятов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Исследование фунгицидной активности выделенных моноизолятов методом агаровых блочков

Микроорганизм	Тест-культура	Диаметр зоны задержки роста, мм
S-1	Helmintosporium sp.	17
	Verticillium sp.	14
	Fusarium sp.	Нет задержки роста
S-2	Helmintosporium sp.	38
	Verticillium sp.	25
	Fusarium sp.	14

Для идентификации отобрали моноизоляты, вокруг которых формировались зоны задержки роста тест-организмов не менее 10 мм (таблица 1). Образуются прямые палочковидные клетки с закругленными краями, расположенные одиночно, попарно или в виде цепочки. Отобранные изоляты ферментируют глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа. Гидролизуют крахмал, желатину, не гидролизует мочевину и утилизируют цитрат. Реакция Фогеса-Проскауэра на образование ацетоина положительная.

По результатам морфологических и культурально-биохимических свойств [5] было установлено, что отобранные культуры S-1 и S-2 относятся к виду Bacillus subtilis.

Для дальнейшей работы выбран штамм Bacillus subtilis S-2, проявивший наибольшую фунгицидную активность.

На поверхности плотных питательных сред Bacillus subtilis S-2 образует сухие морщинистые плоские колонии с неровным краем, на поверхности скошенной питательной среды - сухой морщинистый налет. Через 72 часа инкубирования культура образует центрально расположенные крупные округлые споры.

Дополнительно исследовали методом агаровых блочков воздействие Bacillus subtilis S-2 на рост полезных биологически активных почвенных микроорганизмов. Показано, что микроорганизм не подавляет рост Azotobacter sp., Rhizobium sp, Bradyrhizobium japonicum.

В результате проделанной работы проведен отбор штаммов почвенных микроорганизмов, обладающих фунгицидной активностью. Из ризосферы почвы Северного Казахстана выделена культура Bacillus subtilis S-2, обладающая антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибков Fusarium sp, Helmintosporium sp, Verticillium sp. В дальнейшем данный метод выделения активных культур Bacillus subtilis S-2 может быть использован для получения удобрения на основе бактерий, обладающих фунгицидной активностью.

Литература

1. Боронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений// Биология. 1998, № 3, С. 25-31.

2. Швартау В.В., Гуляев Б.И., Карлова А.Б. Особенности реакции растений на дефицит фосфора// Физиология и биохимия культурных растений. 2009, №3, С. 208-212.

3. Park J., Bolan N., Mallavarapu M. Enhancing the solubility of insoluble phosphorus compounds by phosphate solubilizing bacteria// 19-th World Congres of Soil Science. – Brisbane, 2010, Р. 65-68.

4. Yasmin H., Bano A. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from rhizosphere soil of weeds of khewra salt range and attock// Pakistan Journal of Botany. – 2011, № 3, Р. 1663-1668.

5. Bergey D.H., Robert S.Breed. Bergey's manual of determinative bacteriology. Baltimore, Williams & Wilkins Co., 1957, P. 613-621.