АМИЛОЛИЗ В ПРОРАСТАЮЩИХ ЗЕРНОВКАХ ПШЕНИЦЫПОД ДЕЙСТВИЕМ ТЕПЛОВОГО ШОКА И ЭКЗОГЕННОЙ ГИББЕРЕЛЛОВОЙ КИСЛОТЫ

А.С. Лебедева, А.П. Веселов, И.Ф. Александрова

Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского

В задачу работы входило изучение амилолитической активности в прорастающих зерновках пшеницы в условиях гипертермии и на фоне экзогенной ГК. Семена пшеницы сорта Московская 35 выращивали на отстоянной водопроводной воде или на воде с добавлением гибберелловой кислоты (ГК, 1·10^-5М). Проращивание семян проводили в термостате при температуре 24-26°С, в темноте. Часть проростков на 2, 5 или 7 сутки подвергали тепловому воздействию в термостате в течение двух часов при температуре 42^оС или 46°С. Амилолитическую активность зерновок оценивали по количеству расщепленного крахмала.

Динамика общей активности суммарных (α + β) амилаз и раздельно α - и β - амилаз представлена на рис., из которого видно, что уровень амилолиза возрастал от 2 к 7 суткам. По данным литературы, максимум активности суммарных амилаз в процессе прорастания семян пшеницы обычно приходится на 3-6 сутки (Гильманов и др, 1981; Livesley, 1991). Смещение максимума на более поздний срок в наших опытах, очевидно, связано с тем, что проращивание в течение 7 суток проводилось в темноте. Нарастание амилазной активности в первые дни прорастания семян обусловлено активацией связанных форм β – амилаз за счет отщепления ингибитора, индукцией синтеза α – амилаз «прорастания», усилением секреции в эндосперм α – амилаз «созреания» (Акаева, Фурсов, 1990).

Основная доля активности (рис.1) связана с работой β – амилаз, причем их вклад по мере роста падал (с 94 % до 66 %), а α – амилаз, соответственно, возрастал.

(β)

(β)

(α)

(α)

Рис. 1 Динамика общей активности суммарных (α + β), α- и β- амилаз в процессе

прорастания зерновок пшеницы

Кратковременное тепловое воздействие (42^оС) на проростки различного возраста приводило к увеличению общей суммарной активности в зерновках на 5–16 %, что происходило за счет повышения активности общих форм амилаз. Закономерности в изменении удельной активности были аналогичны общей, поскольку содержание белка в опытном варианте существенно не отличалось от контрольного.

Гипертермия (46°С, 2 часа) также вызывала, как правило, относительно небольшое изменение амилолитической активности у проростков пшеницы разного возраста, но в отличие от варианта «42^оС» эти отклонения от контроля в различные сроки прорастания были не однотипны (табл.). У 2- и 5-дневных зерновок при повышении температуры отмечена тенденция к снижению общей активности амилаз по сравнению с контролем (11-13 %), а у 7-дневных – повышению (22 %).

Таблица

Общая активность амилаз

Сравниваемые варианты	мг крах.* мин^-1 * г^-1 сыр.мас.	p	% к контролю
2-дневные
Контроль	494,0	-	-
46ºС/К	431,0	р>0.05	87,2
ГК/К	759,7	0,02<p<0,05	153,8
ГК,46ºС/К	636,5	р>0.05	129,5
5-дневные
Контроль	1090,6	-	-
46ºС /К	973,4	р>0.05	89,3
ГК/К	1241,3	р>0.05	113,8
ГК,46ºС/К	1186,0	р>0.05	108,7
7-дневные
Контроль	936,9	-	-
46ºС/К	1145,7	р>0.05	122,3
ГК/К	1374,3	0,001<p<0,01	146,7
ГК,46ºС/К	1121,3	р>0.05	119,7

Мы предполагаем, что малосущественные сдвиги в амилолитической активности зерновок под влиянием гипертермии могут быть результатом двух разнонаправленных реакций. С одной стороны, расщепление крахмала способствует повышению осмотического давления и удержанию воды. С другой стороны, при повышении температуры замедляются ростовые процессы, что требует притока меньшего количества углеводов в надземную часть и корни. Вероятно, это является причиной небольшого снижения у 2- и 5-дневных зерновок уровня амилолиза при 46^оС, поскольку в начальный период роста растения наиболее чувствительны к воздействию экстремальных факторов.

Более выраженным по сравнению с высокотемпературным воздействием было влияние экзогенной ГК. В наших опытах при проращивании зерновок на растворе с экзогенной ГК наблюдалось статистически достоверное повышение активности амилаз в 2- (53.8 %) и 7-дневных (46.7 %) проростках пшеницы и недостоверное в 5-дневных (табл.). Такое повышение обусловлено в основном увеличением в амилолизе доли α – амилаз. Известно, что эндогенная ГК стимулирует синтез α – амилаз de novo уже через 16-24 часа после начала прорастания семян пшеницы. Активация амилолиза приводит к более быстрому расщеплению крахмала и, следовательно, более интенсивному процессу роста.

В первые сутки с начала прорастания и в контроле, и при 46^оС в варианте с добавлением экзогенной ГК зафиксировано возрастание амилазной активности (на 22-23 %). Такая ответная реакция ГК вполне объяснима, т.к. синтез ГК в зародыше и щитке и реализация ее действия происходит особенно интенсивно на ранних этапах прорастания.

Общая активность амилаз при воздействии гипертермии на фоне экзогенной ГК была во все исследованные сроки прорастания выше по сравнению с контролем. Это ещё раз говорит о большей отзывчивости процессов биодеградации крахмала к ГК, по сравнению с гипертермией в условиях постановки наших опытов. Таким образом, выращивание проростков на экзогенной ГК модулировало эффект теплового шока, снимая негативное действие гипертермии в начальные сроки роста.

Результаты, свидетельствующие о повышении устойчивости растений к стрессам и болезням под влиянием Nа-солей ГК получены и в исследованиях Л.Д. Прусаковой и др. (2005).

Положительное влияние ГК на устойчивость растений к абиотическим стрессовым факторам отмечается и в обзорной статье Н.А. Рябушкиной (2005). Возможным механизмом подобного эффекта может быть активация в ответ на ГК в клетках алейронового слоя глюконеогенеза и синтеза сахарозы, а также увеличение активности ферментов глиоксилатного цикла (Bethke et al., 1998).

При сравнении эффекта совместного действия ГК и 46^оС с действием одной ГК во все сроки отмечена тенденция к падению уровня амилолиза, но он всегда оставался выше по сравнению с контролем.

На основании полученных нами результатов по определению уровня амилолиза в зерновках пшеницы, подвергшихся разной степени гипертермического воздействия, мы полагаем, что при кратковременном воздействии температур 42^оС и 46^оС прорастающие зерновки находятся на разных стадиях стресс-реакции. При более низкой температуре растения дольше находятся в стадии, когда активируются катаболические реакции. Повышение температуры «заставляет» растения быстрее переходить к стадии адаптации, о чем можно судить по изменению ответной реакции – снижению уровня амилолиза и увеличению доли β – амилаз, которые относят к стресс-индуцируемым белкам (Dreier et al., 1995).

Возрастание вклада β – амилаз при 46^оС могло способствовать увеличению защитного потенциала семян при неблагоприятном воздействии, поскольку работа β – амилаз сопровождается образованием мальтозы – одного из наиболее эффективных осмопротекторов – олигосахаридов.

Экзогенная ГК в ранние сроки прорастания (2 и 5 сутки) оказывает эффект противоположный гипертермии, что «смягчает» реакцию на тепловое воздействие 46^оС.

ЛИТЕРАТУРА

Акаева М.М., Фурсов О.В. Синтез, активация и секреция α-амилазы алейронового слоя щитка зерновки пшеницы // Физиология растений. 1990. Т. 37, вып. 6. С. 1180-1185.

Гильманов М.А., Фурсов О.В., Францев А.П. Методы очистки и изучения ферментов растений. Алма-Ата, 1981. 92 с.

Прусакова Л.Д., Малеванная Н.Н., Белопухов С.Л., Вакуленко В.В. Регуляторы роста растений с антистрессовыми и иммунопротекторными свойствами // Агрохимия. 2005. № 1. С. 76-86.

Рябушкина Н.А. Синергизм действия метаболитов в ответных реакциях растений на стрессовые факторы // Физиология растений. 2005. Т. 52, № 4. С. 614-621.

Bethke P.C., Swanson S.J., Hillmer S., Jones R.L. From storage compartment to lytic organelle: the metamorphosis of the aleurone protein storage vacuole // Annals of Botany. 1998. Vol. 82. P. 399-412.

Dreier W., Schnarrenberger C., Borner T. Light- and stress-dependent enhuncentent of amylolytic activities in white and green barley leaves: β- amylases are stress-induced proteins // Plant Physiol. 1995. V. 145, №3. Р. 342-348.

Livesley M.A. α – Amylase isoenzymes in aged wheat aleurone layers // Biochemical Society Transaction. 1991. V. 19, №4. Р. 360-364.